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Deinococcus radiodurans - Biología

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  1. Takala, H., Niebling, S., Berntsson, O., Björling, A., Lehtivuori, H., Häkkänen, H., Panman, M., Gustavsson, E., Hoernke, M., Newby, G. y Zontone, F., 2016. Cambios estructurales inducidos por la luz en un bacteriofitocromo monomérico.Dinámica estructural, 3(5), pág. 054701. pdf
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  24. Björling, A., Berntsson, O., Lehtivuori, H., Takala, H., Hughes, AJ, Panman, M., Hoernke, M., Niebling, S., Henry, L., Henning, R. y Kosheleva , I., 2016. Fotoactivación estructural de un fitocromo bacteriano de longitud completa. Avances de la ciencia, 2(8), p.e1600920. pdf
  25. Lamparter, T., 2006. Un enfoque computacional para descubrir las funciones de los fitocromos bacterianos mediante el análisis de distribuciones de homólogos. Bioinformática BMC, 7(1), pág.1. pdf

Plantilla: Categoría


Sistema antioxidante de Deinococcus radiodurans

Deinococcus radiodurans es famoso por su extrema resistencia a diversos estreses como la radiación ionizante (IR), la desecación y el estrés oxidativo. El mecanismo subyacente de la resistencia excepcional de esta bacteria robusta aún no estaba claro. Sin embargo, el sistema antioxidante de D. radiodurans ha sido considerado el factor determinante de su inigualable resistencia y protege al proteoma durante el estrés, luego el sistema de reparación del ADN y el sistema metabólico ejercen sus funciones para restaurar la célula a su estado fisiológico normal. El sistema antioxidante no solo está equipado con las enzimas captadoras de especies reactivas de oxígeno (ROS) comunes (por ejemplo, catalasa y superóxido dismutasa), sino que también está equipado con una variedad de antioxidantes no enzimáticos (por ejemplo, carotenoides y especies de manganeso). Y los pequeños complejos de manganeso juegan un papel importante en el sistema antioxidante de D. radiodurans. Estudios recientes han caracterizado varios reguladores (p. Ej., PprI y PprM) en D. radiodurans, que desempeñan funciones críticas en la protección de las bacterias de diversos tipos de estrés. En esta revisión ofrecemos un panorama de los avances en cuanto a las características del sistema antioxidante en D. radiodurans y su aplicación en el futuro.

Palabras clave: Sistema antioxidante Deinococcus radiodurans Manganeso PprI PprM Especies reactivas de oxígeno.

Copyright © 2019 Institut Pasteur. Publicado por Elsevier Masson SAS. Reservados todos los derechos.

Declaracion de conflicto de interes

Declaración de intereses en competencia Los autores declaran que no han publicado ni enviado el manuscrito en otro lugar.


Estructura y metabolismo celular

D. radiodurans es una bacteria grampositiva que generalmente se forma en pares esféricos o tétradas. [4] El aspecto más interesante sobre la estructura celular de D. radiodurans es que conserva de 4 a 10 copias de todos sus genes en un momento dado dependiendo de su etapa actual de crecimiento. Muchos investigadores creen que esto se relaciona con la razón por la que puede soportar tanta radiación. Esta habilidad no depende de algún gen "mágico" que lo proteja de la radiación, más bien, parece que D. radiodurans es capaz de reparar de manera más eficiente las roturas de doble hebra en su ADN que resultan del daño por radiación gracias a estas copias adicionales y algunas otras proteínas especiales. [2]


MATERIALES Y MÉTODOS

Medios y productos químicos

Se utilizó agar nutritivo (NA, Oxoid) para la selección de rutina y el mantenimiento de Escherichia coli son. Para experimentos, E. coli las células se cultivaron utilizando medio Luria-Bertani (LB). Se añadieron los suplementos necesarios: 100 µg / ml de ampicilina. H. pylori La cepa 26695 se adquirió de la Colección Nacional de Cultivos Tipo de Salud Pública de Inglaterra y se mantuvo en placas de Columbia Blood Agar (CBA) que contenían 5% de sangre de oveja desfibrinada (Thermo Fisher Scientific) en cámaras microaerofílicas (Oxoid) en las que la atmósfera se mantuvo con CampyGen 2.5 L sobre (Oxoid). Se añadieron los suplementos necesarios: 5 µg / ml de cloranfenicol, 10 µg / ml de kanamicina. A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos y reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich.

Helicobacter pylori transformación

Para generar H. pylori mutantes, las cepas receptoras se revitalizaron a partir de reservas de glicerol en placas CBA frescas a 37 ° C. Las colonias de cada cepa se expandieron en serie en placas CBA hasta que se logró una capa confluente. Estas células se compactaron en una esfera y se dejaron durante 5 ha 37 ° C para promover el desarrollo natural de la competencia genética. A continuación, la masa de células se transfirió a una placa CBA precalentada y se dejó durante 1 hora a 37ºC. Se añadieron suavemente cinco µg de ADN en un volumen de & lt10 µl encima de la esfera y se mezclaron usando un asa de inoculación. A continuación, las células se compactaron y se incubaron durante la noche a 37ºC. Finalmente, las células se extendieron luego sobre una placa CBA precalentada que contenía antibiótico y se incubaron a 37ºC. Los transformantes generalmente aparecieron después de 4-5 días.

Expresión y purificación de proteínas

los adn El gen de cada especie se amplificó mediante PCR utilizando ADN genómico o un gen sintético (GenScript) y se clonó en pSP015 que contenía His14-SUMO-BANDERA3 etiqueta. Los plásmidos se amplificaron en DH5α y luego se transformaron en BL21 (DE3) -pLysS. Las cepas se cultivaron en medio LB a 37 ° C. A A600 Se añadió IPTG 0,6, 1 mM y los cultivos se incubaron durante 4 ha 30ºC. Para B. subtilis DnaA, las células se recolectaron por centrifugación a 7000 g durante 20 min, se resuspendieron en 40 ml de tampón de unión Ni 2+ (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potasio 250 mM, acetato de magnesio 10 mM, sacarosa al 20%, imidazol 30 mM ) que contiene 1 tableta de inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche # 37378900) y se congela instantáneamente en nitrógeno líquido. Las suspensiones de sedimentos celulares se descongelaron y se incubaron con 0,5 mg / ml de lisozima en hielo durante 1 hora. Las células se rompieron mediante sonicación (5 ciclos de 3 min a 30 W con un intervalo de pulsos / descansos de 2 s). Para eliminar los restos celulares, el lisado se centrifugó a 24 000 g durante 30 min a 4 ° C, luego se pasó a través de un filtro de 0,2 μm para una mayor clarificación. Todos los pasos de purificación adicionales se realizaron a 4 ° C usando un FPLC con un caudal de 1 ml / min.

El lisado clarificado se aplicó a una columna HisTrap HP (GE) de 1 ml, se lavó con 10 ml de tampón de lavado de alta sal Ni 2+ (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potasio 1 M, acetato de magnesio 10 mM, sacarosa al 20%, Imidazol 30 mM) y 10 ml de tampón de elución de Ni2 + al 10% (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato potásico 250 mM, acetato de magnesio 10 mM, sacarosa al 20%, imidazol 1 M). Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de 10 ml (10-100%) de tampón de elución Ni 2+. Las fracciones que contenían la proteína se aplicaron a una columna de afinidad HiTrap Heparin HP (GE) de 1 ml equilibrada en tampón de unión H (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato potásico 100 mM, acetato de magnesio 10 mM, sacarosa al 20%). Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de 20 ml (20-100%) de tampón de elución H (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potasio 1 M, acetato de magnesio 10 mM, sacarosa al 20%). Las fracciones que contenían DnaA (normalmente 3 ml en total) se combinaron y se digirieron durante la noche con 10 μl de His a 10 mg / ml.14-Proteasa Tev-SUMO (23).

La reacción digerida se aplicó a una columna HisTrap HP de 1 ml para capturar monómeros no escindidos, His14-SUMO-tag e His-14-Proteasa TEV-SUMO. Las proteínas DnaA escindidas se recogieron en el flujo continuo y su pureza se confirmó usando SDS-PAGE. Se añadió glicerol (20% final) y se congelaron instantáneamente alícuotas de proteínas en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a -80ºC.

La purificación de homólogos de DnaA de Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis se realizó como se describió anteriormente con la excepción de que las muestras se diluyeron hasta una concentración final de glutamato de potasio de 100 mM antes de ser aplicadas a la columna de heparina.

La purificación de homólogos de DnaA de Synechococcus elongatus, Helicobacter pylori y Deinococcus radiodurans se realizó como se describe anteriormente con las siguientes excepciones. Primero, se omitió la columna de heparina. En segundo lugar, antes de aplicar las proteínas digeridas a una columna HisTrap HP, las muestras se diluyeron hasta una concentración final de imidazol de 50 mM.

Ensayo de unión de análogo de ATP fluorescente

Las proteínas (8 μM final) se incubaron con 0,16 mM de (2 ′ - (o-3 ′) -O- Trifosfato de (trinitrofenil) adenosina (TNP-ATP) (Thermo Fisher Scientific), en 50 μl de tampón de unión (HEPES-KOH 10 mM [pH 8], glutamato de potasio 100 mM, acetato de magnesio 5 mM). Se utilizó una reacción que contenía 8 µM de lisozima como control negativo. Todas las reacciones se realizaron durante 10 min a 25 ° C en una placa negra de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos (Costar # CLS3694). Se excitó TNP-ATP a 410 nm y se detectó emisión de fluorescencia entre 500 y 650 nm utilizando un lector de placas (CLARIOstar Plus, BMG Labtech).

Andamios de ADN

Los andamios de ADN se prepararon en una reacción de 20 μl con cada oligonucleótido (10 μM) mezclado en tampón de recocido de oligo (HEPES-KOH 30 mM [pH 8], acetato de potasio 100 mM y acetato de magnesio 5 mM). Las muestras se calentaron en una máquina de PCR a 95 ° C durante 5 min y luego se enfriaron de 1 ° C / min a 20 ° C antes de mantenerlas a 4 ° C antes de diluirlas a 1 μM en tampón de recocido de oligo y almacenarlas a –20 ° C. Se obtuvieron imágenes de los andamios separados por electroforesis en gel de poliacrilamida (que contiene fluoróforo Cy3 y Cy5) con un escáner láser Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare) a 400 V con excitación a 532 o 635 nm y filtro de emisión LPR (580BP o 665LP respectivamente). Las imágenes se procesaron utilizando Fiji (https://doi.org/10.1038/nmeth.2019). Las sondas de ADN que contienen Cy5 y Black Hole Quencher-2 (BHQ-2) se analizaron utilizando un lector de placas (CLARIOstar Plus, BMG Labtech) con filtros preestablecidos para el fluoróforo Cy5 (Excitation 610-30, Dicroic 637.5, Emission 675- 50) estableciendo la ganancia en 2800.

En un intento por mantener el Tmetro de oligonucleótidos, los tríos de DnaA se mutagenizaron mientras se mantenía el contenido de base (véase la Tabla complementaria S3). Para medir la temperatura de fusión de los sustratos de WT y DnaA-trios MUT relacionados con cada organismo, preparamos una reacción de 20 μl que contenía 0,4 μM de sonda en diferentes tampones de reacción (ver más abajo el tampón de reacción asociado con cada sonda). A continuación, se realizó una curva de fusión de 20 a 95 ° C en la reacción usando una máquina de qPCR Rotor-GenQ (QIAgen) con filtro de excitación 563 y filtro de emisión de paso alto 610 (ganancia: 10). Las curvas obtenidas y el valor de fusión de cada pico se indican en la Tabla complementaria S3.

Ensayo de separación de cadenas de ADN con extintor de agujeros negros (BHQ-SSA)

Cada armazón de ADN que contenía un oligonucleótido con BHQ2, uno con Cy5 y uno sin marcar (concentración final 12,5 nM) se diluyó en tampones apropiados (véase más adelante). Las reacciones se realizaron usando una placa de 96 pocillos de poliestireno negro de fondo plano (Costar # CLS3694). Todas las reacciones se realizaron por triplicado y se detectó fluorescencia cada minuto durante un total de 90 minutos. Para todas las reacciones se realizó un control negativo sin proteína (antecedentes). En cada punto de tiempo, el valor de fondo promedio se resta del valor experimental, informando así la actividad específica de DnaA en un solo sustrato.

Para visualizar directamente los productos de reacción (Figura 2B), se extrajeron 20 μl de muestras y se agregaron a 3,7 μl de solución de parada que contenía 250 nM de competidor sin marcar (la misma secuencia que el oligonucleótido que contiene Cy5), 0,4% de SDS y 1 mg / ml de proteinasa K. Las reacciones se almacenaron en hielo y luego se cargaron en un gel de poliacrilamida al 4% (19: 1) y se ejecutaron a 100 V durante 3 h en tampón que contenía Tris 45 mM, ácido bórico 45 mM y cloruro de magnesio 5 mM.

Ensayo de desenrollado de BUS específico utilizando B. subtilis DnaA. (A) Secuencias de andamio de ADN para B. subtilis y representación esquemática del ensayo de separación de cadenas de Black Hole Quencher (BHQ-SSA). (B) BHQ-SSA utilizando B. subtilis DnaA indica que se requiere ATP para desenrollar el andamio. Un gel de poliacrilamida que muestra la separación específica del oligonucleótido marcado con Cy5 del armazón. (C) BHQ-SSA utilizando B. subtilis Las proteínas DnaA indican que el dedo de arginina (DnaA R264A, en violeta) y el residuo de unión del ssDNA (DnaA I190A, en naranja) son necesarios para el desenrollado del andamio. (D) BHQ-SSA utilizando B. subtilis DnaA indica que tanto las cajas de DnaA como los tríos de DnaA son necesarios para desenrollar el andamio. Los datos representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. El eje Y muestra la unidad arbitraria de fluorescencia (AU).

Ensayo de desenrollado de BUS específico utilizando B. subtilis DnaA. (A) Secuencias de andamio de ADN para B. subtilis y representación esquemática del ensayo de separación de cadenas de Black Hole Quencher (BHQ-SSA). (B) BHQ-SSA utilizando B. subtilis DnaA indica que se requiere ATP para desenrollar el andamio. Un gel de poliacrilamida que muestra la separación específica del oligonucleótido marcado con Cy5 del armazón. (C) BHQ-SSA utilizando B. subtilis Las proteínas DnaA indican que el dedo de arginina (DnaA R264A, en violeta) y el residuo de unión del ssDNA (DnaA I190A, en naranja) son necesarios para el desenrollado del andamio. (D) BHQ-SSA utilizando B. subtilis DnaA indica que tanto las cajas de DnaA como los tríos de DnaA son necesarios para desenrollar el andamio. Los datos representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. El eje Y muestra la unidad arbitraria de fluorescencia (AU).

Para B. subtilis, S. aureus y E. faecalis el tampón de reacción era HEPES-KOH 10 mM (pH 8), glutamato de potasio 100 mM, acetato de magnesio 2 mM, glicerol al 30%, DMSO al 10% y nucleótido 1 mM (ADP o ATP).

Para L. monocytogenes, S. elongatus, H. pylori y D. radiodurans el tampón usado fue HEPES-KOH 10 mM (pH 8), glutamato de potasio 100 mM, acetato de magnesio 2 mM, glicerol al 30% y nucleótido 1 mM (ADP o ATP).

Todas las reacciones se prepararon en hielo para asegurar la estabilidad de la sonda de ADN, luego se dejaron equilibrar a la temperatura de reacción (20 ° C para L. monocytogenes, E. faecalis y S. aureus 25 ° C para B. subtilis, S. elongatus y H. pylori 32 ° C para D .radiodurans). Se añadió proteína DnaA a la concentración final de 130 nM para B. subtilis y D. radiodurans y 650 nM para L. monocytogenes, E. faecalis, S. aureus, S. elongatus y H. pylori. Para B. subitlis en DnaA-Box # 7 MUT y DnaA-Box # 6 se añadió proteína MUT a la concentración final de 650 nM para permitir el desplazamiento de todas las sondas.

Inmunotransferencia

La proteína purificada eluida de 1 ml de columna de afinidad HiTrap Heparin HP (GE) se fijó en tampón de muestra NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) a 98 ° C durante 5 min y los complejos se resolvieron procesando 8 μl de cada muestra en un NuPAGE Novex 4– Gel de tris-acetato al 12% (Thermo Fisher Scientific). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF usando un aparato de transferencia Turbo-Blot y paquetes de transferencia Trans-Blot TurboTM Midi PVDF (Bio-Rad). La membrana se bloqueó con PBS + leche al 5% durante 1 ha temperatura ambiente y luego se incubó con una solución de PBS + leche al 1% que contenía un anticuerpo anti-FLAG monoclonal 1: 2000 (Sigma-Aldrich # F3165) durante 1 ha temperatura ambiente. La membrana se lavó tres veces con PBS + Tween-20 al 0,05% y luego se incubó con PBS + solución de leche al 1% que contenía un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón 1:10 000 (Sigma-Aldrich # A9044). La membrana se lavó tres veces con PBS + Tween-20 al 0,05% y luego se incubó durante 5 min con sustrato Pierce ECL Plus (Thermo Scientific). La quimioluminiscencia se detectó usando un generador de imágenes ImageQuant LAS 4000 (GE Healtcare). Las imágenes se procesaron utilizando Fiji (https://doi.org/10.1038/nmeth.2019).

Reticulación de proteínas

Los andamios de ADN se prepararon mezclando cada oligonucleótido (concentraciones finales de 50 nM) en HEPES-KOH 10 mM (pH 7,6), NaCl 100 mM y EDTA 1 mM, calentando a 98 ° C durante 5 min en un bloque de calor y luego enfriando lentamente hasta temperatura ambiente. Las proteínas DnaA CC (250 nM) se combinaron con un andamio de ADN (25 nM) en HEPES-KOH 10 mM (pH 8), glutamato de potasio 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, acetato de magnesio 10 mM, glicerol al 25%, Tween al 0,01% -20 y 2 mM de nucleótidos (ADP o ATP). Las reacciones se incubaron a 37 ° C durante 6 min, luego se añadieron 2,5 μl de bismaleimidoetano (BMOE) 20 mM (4 mM final) (Thermo Fisher Scientific nº 803561) para reticular las proteínas DnaA CC. Después de 6 min, la reacción se inactivó mediante la adición de 5 µl de cisteína 200 mM (60 mM final) durante 10 min. Las muestras se fijaron en tampón de muestra NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) a 98 ° C durante 5 min y los complejos se resolvieron y visualizaron ejecutando 8 μl de cada reacción siguiendo el método descrito anteriormente. La interpretación de las especies reticuladas se basó en su migración en relación con los marcadores de peso molecular. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente al menos tres veces y se muestran datos representativos.

El programa para buscar la secuencia de BUS

Se diseñó un programa para identificar las secuencias BUS en los orígenes de la replicación bacteriana basado en el patrón de regiones de desenrollamiento experimentales y pronosticadas (22). Durante el proceso de entrenamiento, el programa se ajustó para generar las mismas secuencias predichas que las identificadas por el análisis previo de veinte oriCs, para generar los parámetros y reglas requeridos por el programa (Tabla complementaria S1 y Figura S2). En general, la secuencia de BUS consta de tres partes: DnaA-box, espaciador y motivos repetidos de DnaA-trios. Los parámetros determinados de las tres partes durante el proceso de formación se presentan a continuación:

Motivo estándar de la DnaA-box. Si la especie tiene una caja DnaA divergente en DoriC (21, 24), el motivo estándar de la caja DnaA era el específico de la especie, mientras que en los otros casos era el E. coli motivo de caja de DnaA de mayor afinidad (5′-TTATCCACA-3 ′).

Desajustes de la caja de DnaA predicha. Si la longitud del motivo estándar es de 9 pb y solo hay un cuadro de DnaA presente, entonces la discordancia máxima se estableció en 2. Si la longitud del motivo estándar es de 9 pb y hay un par de cuadros de DnaA presentes, entonces la discordancia máxima no es más de 2 (la caja de DnaA más conservada) o 4 (la caja de DnaA menos conservada). Si la longitud del motivo estándar es más de 9 pb, el máximo desajuste de la suela (si es singular) o el más conservado (si es tándem) aumenta a 3.

Longitud del espaciador entre elprimer DnaA-box localizado y los primeros DnaA-tríos. De acuerdo con la Tabla complementaria S1, asumimos que el espaciador más largo puede incluir: la secuencia entre dos cajas de DnaA (máximo 3 pb), una caja de DnaA menos conservada (generalmente 9 pb) y la segunda región de brecha anteriormente denominada región rica en GC (4 pb de media). Por lo tanto, la longitud máxima prediseñada del espaciador se establece en 16 pb, que es la suma de las tres partes.

Patrón de los tríos de DnaA. La base en el medio de cada motivo de trinucleótidos DnaA-tríos es una adenina conservada. Análisis de la B. subtilis DnaA-trios sugirió que un conjunto de tres motivos se requería mínimamente para la actividad de origen (22). Por lo tanto, el patrón general de DnaA-tríos se estableció como (.A.) <3,>, lo que significa que no se permiten menos de tres motivos de NAN (N es cualquier base).

El proceso de búsqueda se divide en dos pasos (Figura complementaria S2B). Primero, el programa busca la secuencia candidata con el patrón general de la secuencia BUS (Figura complementaria S2D). En este paso, localiza una caja de DnaA (la primera caja de DnaA localizada) (desajuste ≤2) con una distancia de 0 a 16 pb del trío de DnaA. Después, se busca en la segunda caja de DnaA (desajuste ≤4) aguas arriba o aguas abajo de la caja de DnaA identificada en el primer paso. Cabe señalar que si esta última caja de DnaA se identifica aguas arriba de la primera y parece tener menos desajustes, la longitud real del espaciador se cuenta desde la segunda caja de DnaA ubicada y, por lo tanto, será más de 16 bp.

El proceso de selección se divide en tres pasos (Figura complementaria S2C). Primero, el programa conserva las secuencias candidatas con la puntuación más alta de DnaA-trios. Luego, se retienen las secuencias candidatas que contienen el número mínimo de desajustes en la caja de DnaA (la única si es singular o la más conservada si es tándem). Después de estos dos pasos, el & gt94% de los genomas tiene una única secuencia candidata. En tercer lugar, se retienen las secuencias candidatas con la longitud del espaciador más cercana a 13 pares de bases, ya que es la longitud del espaciador más común. Después de este paso, a casi todos (& gt99%) los genomas les queda una única secuencia candidata.


Acerca de este sitio

Este sitio fue creado como una tarea para mi clase de biología de organismos en la primavera de 2008. Se nos pidió que creáramos una página web sobre cualquier organismo de nuestra elección.

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¡Gracias especiales!

Quiero aprovechar este momento para enviar un agradecimiento especial a Michael Daly por el uso de sus fotografías y toda la increíble investigación que me proporcionó. Además, Dennis Kunkel amablemente me permitió el uso de sus micrografías electrónicas. La Dra. Bonnie Bratina hizo todo lo posible para proporcionarme fotografías de su viaje a la Antártida. Por supuesto, el sitio web no se habría creado con la ayuda del Dr. Volk y el Dr. Sandland.

Sobre el Autor

Mi nombre es Meagan Arnold y soy estudiante de tercer año en la Universidad de Wisconsin-LaCrosse. Soy un estudiante de ciencias biomédicas con un título de química. Mis raíces se encuentran en la pequeña ciudad agrícola de Evansville, WI. Como la gran mayoría de los estudiantes universitarios, mis planes futuros están en el aire. Ya sea medicina, fisioterapia o investigación, mi amor por aprender ciencia es inquebrantable. Otras pasiones mías son bastante diversas. Hornear, tocar la trompeta, nadar, correr, los amigos y la familia ocupan gran parte de mi tiempo, a veces más de lo que deberían :). Soy el mejor en procrastinar y me enorgullezco de mi habilidad para hornear un pastel de manzana increíble.

Por qué Deinococcus ?

Así que probablemente te estés preguntando por todos los organismos en tsu planeta, ¿por qué elegiría Deinococcus radiodurans? En mi clase de introducción a la microbiología, se requirió aprender una gran cantidad de microorganismos. Deinococcus radiodurans siempre me llamó la atención. Quiero decir, vamos, puede sobrevivir a la radiación ionizante de los desechos nucleares, ¿se vuelve mucho más frío que eso?

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2 respuestas 2

Según la sección "Adaptación funcional" de esta página web, Deinococcus radiodurans usa proteínas reparadoras para unir el ADN después del daño por radiación. Es decir, después de una explosión de radiación, el ADN estará en pedazos y las proteínas reparadoras lo volverán a unir. Parece que este mecanismo no entraría en juego durante otras formas de mutación del ADN que ocurren durante la replicación, como mutaciones puntuales o inversiones.

Deinococcus radiodurans no "desarrolló resistencia a mutaciones".

Es capaz de reparar su cromosoma cuando se dispersa en pedazos por radiaciones o desecación, mientras que otras bacterias morirían en tales condiciones.

Entonces, esto es adaptativo en ambientes extremos, como los desiertos (donde ha evolucionado) o la carne en conserva enlatada (donde se descubrió).


Materiales y métodos

Cepas, condiciones de crecimiento y tratamiento.

Las cepas y plásmidos usados ​​en este estudio se describen en la Tabla 2. Todos los genes se identifican como se describe en la secuencia del genoma publicada (http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.spl?database=gdr). Todas las cepas derivadas de D. radiodurans se cultivaron a 30ºC en caldo TGY (triptona al 0,5%, extracto de levadura al 0,3% y glucosa al 0,1%) o en agar TGY (agar al 1,5%). Se cultivaron cepas de E. coli en caldo Luria-Bertani (LB) o en placas LB a 37 ° C. Los plásmidos se propagaron de forma rutinaria en la cepa DH5αMCR de E. coli. Se evaluó la capacidad de los cultivos de D. radiodurans para sobrevivir a la exposición a agentes que dañan el ADN en crecimiento exponencial (DO600 = 0,08 - 0,15, 5 x 10 6 - 1 x 10 7 ufc / ml). Todos los cultivos se trataron a 25 ° C. La irradiación gamma se realizó usando un irradiador modelo 484R 60 Co (J. L. Shepherd and Associates, San Fernando, California, Estados Unidos) a una velocidad de 30 Gy / min. La resistencia a la mitomicina C se determinó añadiendo 1 mg de mitomicina C (Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos) a cultivos de caldo de 1 ml de la cepa D. radiodurans. Se retiraron alícuotas del cultivo tratado a intervalos de media hora durante las siguientes 2 h, se lavaron en MgSO4 10 mM y se sembraron en placas de agar TGY para determinar la viabilidad.

Construcción de TNK104, TNK106 y TNK110.

Los genes ddrA y recA fueron interrumpidos por mutagénesis dirigida usando técnicas descritas previamente (Funayama et al. 1999). Se creó un casete de deleción para cada locus y se transformó en un cultivo de D. radiodurans R1 en fase exponencial. Los recombinantes se seleccionaron en placas TGY que contenían un antibiótico apropiado. Dado que D. radiodurans es multigenómico, se examinaron colonias individuales para determinar si eran homocigotas para la alteración aislando el ADN genómico de los recombinantes putativos y utilizando un análisis basado en PCR para determinar si el gen de interés había sido eliminado. Los detalles de cómo se generó cada cepa se dan a continuación.

La construcción de TNK104 comenzó con la creación de un casete de fármaco capaz de conferir resistencia a la higromicina en D. radiodurans. El gen de la higromicina B fosfotransferasa (hig) from pHP45omega-hyg (Blondelet-Rouault et al. 1997) was spliced to the 120 bp of sequence immediately upstream of the initiation codon of the D. radiodurans katA gene (DR1998) (Funayama et al. 1999), using primers whose sequences overlapped. Subsequently, the katA–hyg fusion product was joined to PCR fragments (Horton et al. 1989) derived from the sequence 1.0 kbp immediately upstream and 0.9 kbp immediately downstream of ddrA. This hybrid fragment was cloned into pGEM-T (Promega, Madison, Wisconsin, United States), creating pTNK205. pTNK205 was propagated in E. coli DH5α-MCR. The deletion of ddrA was accomplished by transforming (Earl et al. 2002b) an exponential-phase R1 culture with linear pTNK205. Hygromycin-resistant recombinants were selected on TGY plates containing 37.5 μg/ml hygromycin.

To confirm gene replacement, primers, which anneal outside the coding sequence of ddrA, were used to generate PCR fragments from genomic DNA from hygromycin-resistant colonies and R1. The purified PCR products were restricted with EcoRI and EcoRV. los hyg gene contains an EcoRI site, but ddrA no. ddrA contains an EcoRV site, but hyg no. In the recombinant, designated TNK104, a single 1.3-kbp fragment, corresponding to the katA–hyg cassette was amplified, whereas there was no trace of the 0.85-kbp fragment, indicative of ddrA amplification (see Figure 1A). EcoRI cleaved the product amplified from TNK104 into 0.2-kbp and 1.1-kbp fragments, while the R1-derived product remained intact (Figure 1B). EcoRV digested the amplicon from R1 into fragments of 0.4 kbp and 0.45 kbp, but it did not affect the TNK104-derived product (Figure 1C). We conclude that TNK104 carries a deletion of the ddrA coding sequence marked by the katA–hyg cassette and that the strain is homozygous for the deletion.

los recA deletion strain TNK106 was constructed in a manner similar to that of TNK104. Initially, the katA promoter of D. radiodurans was fused to the chloramphenicol acetyltransferase gene (cat) from pBC (Stratagene, La Jolla, California, United States). This drug cassette was then spliced to PCR products corresponding to genomic DNA sequences 1.6 kbp upstream and 1.2 kbp downstream of recA by overlap extension, before being cloned into pGEM-T. The resulting plasmid was designated pTNK210. An exponential-phase R1 culture was transformed with the replacement cassette from pTNK210, and chloramphenicol-resistant recombinants were selected on TGY plates containing 3 μg/ml chloramphenicol. Genomic DNA of each recombinant was amplified to determine if the recA coding region was deleted. Purified PCR products amplified using primers that anneal to sequences flanking recA were treated with PvuII and BglII. los gato gene carries a PvuII site, but recA no. recA contains a BglII site, but gato no. A 1.3-kbp fragment, corresponding to the katA–cat cassette, was obtained from a recombinant designated TNK106, but DNA from this recombinant did not generate the 1.5-kbp fragment corresponding to recA (Figure 1A). Amplifications of genomic DNA from R1 only produced the 1.5-kbp fragments (Figure 1A). The 1.3-kbp PCR product from TNK106 was cleaved by PvuII to 0.5-kbp and 0.8-kbp fragments, whereas the 1.5 kbp from R1 remained intact (Figure 1C). BglII cut the R1-derived 1.5 kbp to fragments of 0.45 kbp and 1.05 kbp, but not the product from TNK106 (Figure 1C). We conclude that recA has been replaced by katA–cat in TNK106 and that the strain is homozygous for this allele. TNK110 is a double mutant in which recA y ddrA are deleted. This strain was constructed by deleting recA from TNK104 using the protocol described for the creation of TNK106. The construct was verified by the scheme used to identify ddrA deletion in TNK104 and recA deletion in TNK106 (see Figures 1A and 1C).

Pulsed-field gel electrophoresis.

After irradiation at 5.0 kGy, cells were collected by centrifugation (6,000g, 15 min, 4 °C) and resuspended in either TGY broth or 10 mM MgSO4 solution, before being placed in a shaking incubator at 30 °C for 24 h. Aliquots of these cultures were removed at various time points, and cells were washed in 0.9% NaCl and suspended in 0.125 M EDTA (pH 8.0) at a density of 5 × 10 8 cells/ml. The suspensions were mixed with low-melting-point agarose (Sigma) to obtain a final concentration of 0.8% agarose. Agarose blocks containing the cell suspension were incubated overnight at 37 °C in 0.05 M EDTA (pH 7.5) containing 1 mg/ml of lysozyme. After lysozyme treatment, agarose plugs were placed in ESP buffer (EDTA 0.5 M [pH 9–9.5], 1% lauroyl sarcosine, 1 mg/ml proteinase K) at 50 °C for 6 h, followed by a 2-d incubation at 37 °C. Prior to digestion with restriction enzymes, agarose plugs were washed once with TE buffer (pH 7.5) containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and then four times with TE buffer (pH 7.5). DNA contained within the agarose plugs was digested with 10 U of NotI restriction enzyme (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, United States) overnight at 37 °C. Restriction digests were analyzed on 1% agarose gels in 0.5X TBE, using a CHEF-MAPPER electrophoresis system (Bio-Rad, Hercules, California, United States) at 6 V/cm for 22 h at 12 °C, with a linear pulse ramp of 10–60 s and a switching angle of 120°. Gels were stained with water containing 0.5 μg/ml ethidium bromide for 20 min and destained for 10 min in water.

Quantitative real-time PCR.

The protocol followed was the same as that described previously (Earl et al. 2002a). Total RNA was extracted from 1-l cultures of irradiated and nonirradiated exponential-phase D. radiodurans cultures using TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio, United States) following manufacturer's instructions. Cell disruption was accomplished by adding 100 μ1 of 0.1-mm zirconia/silica beads (Biospec Products, Bartlesville, Oklahoma, United States) and TRI Reagent to the cell paste from 1 l of cells and vigorously agitating this mixture for 6 min with a vortex mixer. Two micrograms of each DNase I–treated, purified RNA sample was converted to cDNA using SUPERSCRIPT II RNase H − Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, California, United States) combined with 25 pmol of random hexamers to initiate synthesis. Conditions for this reaction followed the manufacturer's instructions.

Approximately 100 bp of unique sequence from the genes encoding DdrA (DR0423), RecA (DR2340), and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (DR1343) were amplified using the following primer sets: DR0423up (5′-GGTGCAGGACCGACTCGACGCCGTTTGCC-3′), DR0423down (5′-CCTCGCGGGTCACGCCGAGCACGGTCAGG-3′), DR2340up (5′-GTCAGCACCGGCAGCCTCAGCCTTGACCTC-3′), DR2340down (5′-GATGGCGAGGGCCAGGGTGGTCTTGC-3′), and DR1343up (5′-CTTCACCAGCCGCGAAGGGGCCTCCAAGC-3′), DR1343down (5′-GCCCAGCACGATGGAGAAGTCCTCGCC-3′). The PCR reaction (50 μ1) for amplifying these genes contained the appropriate primers at a final concentration of 0.2 μM, 1 μ1 of the cDNA template, and SYBR Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems, Foster City, California, United States). Amplifications were carried out by incubating reactions at 95 °C for 3 min prior to 40 cycles of 30 s at 95 °C, followed by 30 s at 65 °C and 30 s at 72 °C. Data were collected and analyzed at each 72-°C interval. Each 96-well plate consisted of standard curves for each primer set run in duplicate. Standard curves were constructed using cDNA obtained from the unirradiated wild-type organism. A dilution series (1 to 1 × 10 −4 ) of each experimental sample was generated and run in duplicate. Negative controls without a cDNA template were run on every plate analyzed. All assays were performed using the iCycler iQ Real-Time Detection System (Bio-Rad). All data were PCR-baseline subtracted before threshold cycle values were designated and before standard curves were constructed. Mean concentrations of the transcripts in each sample were calculated from the standard curves generated using the recA primer set. Induction levels were determined by dividing the calculated concentration of transcript from the irradiated sample by the concentration of transcript from the unirradiated sample for each strain. The mean concentration of the gap transcript, a housekeeping gene whose expression is unaffected by ionizing radiation, was also determined before and after irradiation for each strain.

DNA content measurement in TNK104 and R1 cells.

Overnight cultures growing in TGY medium were harvested at room temperature. Control culture aliquots were fixed with 1% toluene (final vol/vol), shaken vigorously, and stored at 4 °C. The fixed bacteria were diluted (1/10, 1/100, and 1/1,000) in 3 ml (final volume) of dilution buffer: 10 mM NaCl, 6.6 mM Na2ASI QUE4, 5 mM N′-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES pH 7.0). The remaining cultures were centrifuged for 20 min at 4 °C at 7,000 rpm. Bacterial pellets were washed twice and resuspended in 10 mM MgSO4 for γ irradiation. Cell suspensions were irradiated at 5,000 Gy and incubated at 30 °C for 120 h. Aliquots were removed immediately following irradiation, at 48 h, and at 120 h postirradiation. Cells were toluene-fixed as described above 100 μ1 of DAPI (stock solution 3 μg/ml) was added to each dilution tube and mixed. The fluorescence intensity was determined after excitation at 350 nm by measuring emission at 450 nm.

Cloning, overexpression, and purification of DdrA.

los ddrA gene was amplified using the genomic DNA from D. radiodurans strain R1. PCR primers were designed according to the ddrA gene sequence annotated in the genomic bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). The gene was cloned in E. coli overexpressing plasmid pEAW298. DdrA-overproducing cells were lysed with lysozyme, and the protein was precipitated from the supernatant by adding ammonium sulfate to 30% saturation. The protein was purified with DEAE and hydroxyapatite chromatography to greater than 99% purity. The identity of the purified protein was confirmed by N-terminal sequencing (Protein and Nucleic Acid Chemistry Laboratory, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, United States) and accurate mass determination (Biotech Center, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, United States). The protein was transferred into the storage buffer (20 mM Tris-acetate, 80% cation [pH 7.5]/50% glycerol [w/v], 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, and 1 mM DTT) and stored at −80 °C.

Determination of the extinction coefficient for pure DdrA protein.

The extinction coefficient for DdrA protein was determined using a modification of a published procedure (Marrione and Cox 1995). UV absorbance spectra were measured with a Cary 300 dual-beam spectrophotometer (Varian, Palo Alto, California, United States). The temperature was maintained using a circulating water bath. Cell-path length and bandwidth were 1 cm and 0.5 nm, respectively. The extinction coefficient for native DdrA protein was determined in the storage buffer, by comparing the absorbance spectra of the native protein to the absorbance spectra of the protein denatured in 6 M guanidine hydrochloride (Gnd–HCl) in storage buffer. The extinction coefficients at 280 nm of glycyl- L -tyrosylglycine and norte-acetyl- L -tryptophanamide in 6 M GND–HCl are 1,280 M −1 cm −1 and 5,690 M −1 cm −1 , respectively (Edelhoch 1948). In the DdrA protein there are five tyrosine, five tryptophan, and two cysteine residues in a protein with a total molecular mass of 23 kDa. Even if all cysteine residues were involved in disulfide bonds, the contribution of cystine to the absorbance of DdrA protein is predicted to be less than 1% and was neglected from our calculations. The extinction coefficient at 280 nm for denatured DdrA protein in εdenat, 280 nm = 5 × 5,690 + 5 × 1,280 = 3.485 × 10 4 M −1 cm −1 . Absorbance spectra of native and denatured (6 M GND–HCl) DdrA protein were scanned at 25 °C, from 320 to 240 nm, for five different dilutions and with two different protein preparations. DdrA protein was diluted in storage buffer or storage buffer plus 6 M GND–HCl (final concentration) in a total volume of 80 μ1 and was preincubated at 25 °C for 5 min before scanning. Each dilution was carried out in triplicate, and the absorbance values at 280 nm were averaged. The concentrations of native and denatured protein were equal to each other in each scan at each dilution. The extinction coefficient of native DdrA protein at 280 nm was determined according to the expression (Gill and von Hippel 1989): εnat, 280 nm = εdenat, 280 nm × Absnat, 280 nm/Absdenat, 280 nm. We used five determinations with two different protein preparations, yielding an average extinction coefficient of εnat, 280 nm = 2.8728 ± 0.1999 × 10 4 M −1 cm −1 in storage buffer at 25 °C. The A280/A260 ratio for the native DdrA protein is 1.575 ± 0.00091. The error in both cases is 1 s.d.

DNA binding assay.

The duplex oligonucleotide with a 3′ single-stranded extension was hairpin-forming oligonucleotide A (5′-TTA ACG ACC GTC GAC CTG CAG GTC GAC GGT CGT TAA CGT CTC TCA GAT TGT-3′), which was labeled at the 3′ terminus with [α- 32 P]ddATP, using terminal transferase. After labeling, hairpin formation generated an 18-bp duplex hairpin with a 16-nt 3′ extension. The duplex oligonucleotide with a 5′ single-stranded extension was hairpin-forming oligonucleotide B (5′-CGT CTC TCA GAT TGT TTA ACG ACC GTC GAC CTG CAG GTC GAC GGT CGT TAA-3′). The oligo was labeled at the 5′ end using [γ- 32 P] ATP and polynucleotide kinase. After labeling, hairpin formation generated a DNA with 18 bp in the hairpin duplex and a 15-nt 5′ extension. A blunt-ended duplex DNA fragment was prepared by annealing oligonucleotide C (5′-GGT CTT TCA AAT TGT TTA AGG AAG AAA CTA ATG CTA GCC ACG GTC CGA GCC-3′) 32 P-labeled at its 5′ end, with unlabeled oligonucleotide D (5′-GGC TCG GAC CGT GGC TAG CAT TAG TTT CTT CCT TAA ACA ATT TGA AAG ACC-3′). The single-stranded oligonucleotide was the end-labeled oligo C. EMSAs for DNA binding were carried out in 15-μl reaction mixtures containing the reaction buffer (40 mM Tris-acetate [pH 7.5],10% glycerol [w/v], 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) and 0.7 nM (60 nM nt) 32 P-labeled duplex DNA. The reaction was initiated by adding the DdrA protein to the required concentration. The reaction mixture was incubated at 30 °C for 30 min and loaded onto a 10% native polyacrylamide gel. The electrophoresis was performed in 1X TBE (89 mM Tris-borate [pH8.3], 2 mM EDTA) at room temperature. After the electrophoresis was completed, the gel was dried and exposed with a Phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, United States).

Identification of DdrA protein in DNA–protein complex.

The general strategy of this experiment was to incubate a DNA duplex with a 3′ extension with DdrA protein, resolve the protein complex in native PAGE, excise the complex from the gel, extract the protein from the slice, and analyze the protein in SDS-PAGE. If the protein is DdrA, it will comigrate with DdrA protein in SDS-PAGE.

A 32 P-labeled oligonucleotide (30 nt 5′-GTG CGC TCC GAG CTC AGC TAC CGC GAG GCC-3′) was annealed with a longer unlabeled oligonucleotide (50 nt 5′-GGC CTC GCG GTA GCT GAG CTC GGA GCG CAC GAT TCG CAC TGC TGA TGT TC-3′). Annealing was carried out in a 40-μ1 solution containing 0.5 μM of each oligonucleotide in 25 mM Tris HCl (pH 8), 50 mM NaCl, and 12.5 mM MgC12. The solution was heated briefly at 100 °C, by transferring the closed tube to a beaker of boiling water, and allowed to cool slowly overnight. The tube was refrigerated for several hours and then stored at −20 °C until use.

The resulting labeled duplex DNA with a 3′ extension (0.7 nM) was incubated with 4 μM DdrA protein under the DNA binding conditions described above. The mixture was loaded onto a 10% native polyacrylamide gel. Electrophoresis was performed as described above. The gel was exposed with X-ray film to map the position of the protein–duplex complex. The complex was cut out of the gel. The gel slice was frozen in liquid nitrogen and crushed into a slurry with a plastic stick. The slurry was mixed with an equal volume of SDS-PAGE loading buffer and boiled for 3 min. The mixture was loaded onto a 12% SDS-PAGE gel and the protein present compared to molecular weight standards and purified DdrA protein.

Exonuclease assay.

The duplex with a 3′ extension was prepared by annealing oligonucleotide A (5′-CTA GCA TTA GTT TCT TCC TTA AAC AAT TTG AAA GAC C-3′), which was labeled at the 5′ terminus with [γ- 32 P]ATP, and cold oligonucleotide B (5′-GGT CTT TCA AAT TGT TTA AGG AAG AAA CTA ATG CTA GCC ACG GTC CGA GCC-3′). The annealing generated a 14-nt 3′ extension at one end of the short duplex. Before adding the exonuclease, the 32 P-labeled duplex (60 nM nt) was preincubated with the DdrA protein at the indicated concentration in 15 μl of the exonuclease reaction buffer (40 mM Tris-acetate [pH 7.5], 0.1 M NaCl, 10 mM MgC12, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) at room temperature for 10 min. In the control experiment, the DdrA protein was replaced with bovine serum albumin. Exonuclease I was added to 200 U/ml and the reaction mixture was incubated at 37 °C for 30 min. After the incubation was complete, the reactions 5 and 6 were deproteinized with 0.2% SDS and 0.2 mg/ml proteinase K at 37 °C for 15 min. The DNA–protein complexes were resolved in the native polyacrylamide gel as above.


Structural and biochemical evidence supporting poly ADP-ribosylation in the bacterium Deinococcus radiodurans

Poly-ADP-ribosylation, a post-translational modification involved in various cellular processes, is well characterized in eukaryotes but thought to be devoid in bacteria. Here, we solve crystal structures of ADP-ribose-bound poly(ADP-ribose)glycohydrolase from the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans (DrPARG), revealing a solvent-accessible 2'-hydroxy group of ADP-ribose, which suggests that DrPARG may possess endo-glycohydrolase activity toward poly-ADP-ribose (PAR). We confirm the existence of PAR in D. radiodurans and show that disruption of DrPARG expression causes accumulation of endogenous PAR and compromises recovery from UV radiation damage. Moreover, endogenous PAR levels in D. radiodurans are elevated after UV irradiation, indicating that PARylation may be involved in resistance to genotoxic stresses. These findings provide structural insights into a bacterial-type PARG and suggest the existence of a prokaryotic PARylation machinery that may be involved in stress responses.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Cifras

Crystal structures of apo and…

Crystal structures of apo and ADP-ribose-bound forms of DrPARG. a , B Structure…

Detailed view of the ADP-ribose…

Detailed view of the ADP-ribose binding pocket of DrPARG. A detailed comparison of…

Detection of endogenous poly-ADP-ribose (PAR)…

Detection of endogenous poly-ADP-ribose (PAR) in Deinococcus radiodurans . a PAR formation assayed…

Structural model of DrPARG-PAR (poly-ADP-ribose)…

Structural model of DrPARG-PAR (poly-ADP-ribose) complex in endo-glycohydrolase mode. a Solvent-accessible surface of…

Enzyme activity of DrPARG. a…

Enzyme activity of DrPARG. a Michaelis–Menten plots of wild-type (WT), T267R, T267K, and…


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