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11.E: Biología Molecular (Ejercicios) - Biología

11.E: Biología Molecular (Ejercicios) - Biología



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Opción multiple

¿Con cuál de los siguientes se empareja la citosina?

A. guanina
B. timina
C. adenina
D. una pirimidina

A

Los procariotas contienen un cromosoma ________ y ​​los eucariotas contienen cromosomas ________.

A. circular monocatenaria; lineal monocatenario
B. lineal monocatenario; circular de una sola hebra
C. circular de doble hebra; lineal de doble hebra
D. lineal de doble hebra; circular de doble hebra

C

Respuesta libre

Describe la organización del cromosoma eucariota.

El ADN se enrolla alrededor de proteínas llamadas histonas. Luego, las histonas se apilan juntas en una forma compacta que crea una fibra de 30 nm de espesor. La fibra se enrolla aún más para lograr una mayor compacidad. Durante la metafase de la mitosis, el cromosoma es más compacto para facilitar el movimiento cromosómico. Durante la interfase, hay áreas más densas de cromatina, llamadas heterocromatina, que contienen ADN que no se expresa, y eucromatina menos densa que contiene ADN que se expresa.

Describe la estructura y el apareamiento de bases complementarias del ADN.

Una sola hebra de ADN es un polímero de ácidos nucleicos unidos covalentemente entre el grupo fosfato de uno y el azúcar desoxirribosa del siguiente para una "columna vertebral" de la que sobresalen las bases nitrogenadas. En su estado natural, el ADN tiene dos hebras enrolladas entre sí en una doble hélice. Las bases de cada hebra están unidas entre sí mediante enlaces de hidrógeno. Solo las bases específicas se unen entre sí; la adenina se une a la timina y la citosina se une a la guanina.

Opción multiple

¿El ADN se replica mediante cuál de los siguientes modelos?

A. conservador
B. semiconservativo
C. dispersivo
Re. Ninguna de las anteriores

B

El mecanismo inicial para reparar errores de nucleótidos en el ADN es ________.

A. reparación de desajustes
B. Revisión de la ADN polimerasa
C. reparación por escisión de nucleótidos
D. dímeros de timina

B

Respuesta libre

¿Cómo se aseguran los cromosomas lineales en eucariotas de que sus extremos se repliquen por completo?

La telomerasa tiene una plantilla de ARN incorporada que extiende el extremo 3 ', por lo que se sintetiza y extiende un cebador. Por lo tanto, los extremos están protegidos.

Opción multiple

Un promotor es ________.

A. una secuencia específica de nucleótidos de ADN
B. una secuencia específica de nucleótidos de ARN
C. una proteína que se une al ADN
D. una enzima que sintetiza ARN

A

Las partes de la secuencia de ARNm eucariota que se eliminan durante el procesamiento del ARN son ________.

A. exones
B. gorras
C. colas poli-A
D. intrones

D

Opción multiple

Los componentes de ARN de los ribosomas se sintetizan en el ________.

A. citoplasma
B. núcleo
C. nucleolus
D. retículo endoplásmico

C

¿Cuánto tiempo tendría el péptido que se traduce de esta secuencia de ARNm: 5'-AUGGGCUACCGA-3 '?

A. 0
B. 2
C. 3
D. 4

D

Respuesta libre

Transcriba y traduzca la siguiente secuencia de ADN (cadena sin plantilla): 5'-ATGGCCGGTTATTAAGCA-3 '

El ARNm sería: 5'-AUGGCCGGUUAUUAAGCA-3 '. La proteína sería: MAGY. Aunque hay seis codones, el quinto codón corresponde a una parada, por lo que el sexto codón no se traduciría.

Opción multiple

¿En qué nivel (s) se produce el control de la expresión génica en células eucariotas?

A. solo el nivel transcripcional
B. niveles epigenéticos y transcripcionales
C. niveles epigenéticos, transcripcionales y traslacionales
D. niveles epigenéticos, transcripcionales, postranscripcionales, traslacionales y postraduccionales

D

El control postraduccional se refiere a:

A. regulación de la expresión génica después de la transcripción
B. regulación de la expresión génica después de la traducción
C. control de la activación epigenética
D. período entre la transcripción y la traducción

B

Respuesta libre

Describa cómo el control de la expresión génica alterará los niveles generales de proteína en la célula.

La célula controla qué proteína se expresa y hasta qué nivel se expresa esa proteína en la célula. Las células procariotas alteran la tasa de transcripción para activar o desactivar genes. Este método aumentará o disminuirá los niveles de proteínas en respuesta a lo que necesita la célula. Las células eucariotas cambian la accesibilidad (epigenética), la transcripción o la traducción de un gen. Esto alterará la cantidad de ARN y la vida útil del ARN para alterar la cantidad de proteína que existe. Las células eucariotas también cambian la traducción de la proteína para aumentar o disminuir sus niveles generales. Los organismos eucariotas son mucho más complejos y pueden manipular los niveles de proteínas cambiando muchas etapas en el proceso.


Polímeros en biología y medicina

Abstracto

La resina, la proteína altamente elastomérica que se encuentra en los compartimentos especializados de la mayoría de los artrópodos, exhibe una resistencia superior y una excelente capacidad de respuesta de alta frecuencia en comparación con muchas otras proteínas estructurales. Facilitado a través de estrategias biosintéticas, polipéptidos repetitivos similares a resilina (RLP) derivados de las secuencias de consenso de principalmente Drosophila melanogaster, y más recientemente de otros insectos, se han producido y caracterizado. Con el mantenimiento de las propiedades mecánicas de la resilina natural, los RLP se han ampliado aún más con la incorporación de dominios biológicos, con el objetivo de generar biomateriales que respondan a las células en la ingeniería de tejidos mecánicamente activos como tejidos cardíacos, cuerdas vocales y vasos sanguíneos.


1. Introducción

1.1. Los segmentos de proteínas no caracterizados son una fuente de novedad funcional

Durante la última década, hemos observado un aumento masivo en la cantidad de información que describe las secuencias de proteínas de una variedad de organismos. 1,2 Si bien esto puede reflejar la diversidad en el espacio de secuencia, y posiblemente también en el espacio de función, 3 una gran proporción de las secuencias carece de alguna anotación de función útil. 4,5 A menudo, estas secuencias se anotan como proteínas putativas o hipotéticas y, para la mayoría, sus funciones aún se desconocen. 6,7 Las sugerencias sobre la función potencial de las proteínas, principalmente la función molecular, a menudo provienen del análisis computacional de sus secuencias. Por ejemplo, la detección de homología permite la transferencia de información de segmentos de proteínas bien caracterizados a aquellos con secuencias similares que carecen de anotación de función molecular. 8 & # x0221210 Otros aspectos de la función, como los procesos biológicos en los que participan las proteínas, pueden provenir de estudios genéticos y de asociación de enfermedades, datos de redes de expresión e interacción y enfoques genómicos comparativos que investigan el contexto genómico. 11 & # x0221217 Se espera que la caracterización de segmentos de proteínas no anotados y no caracterizados conduzca al descubrimiento de nuevas funciones y proporcione información importante sobre los procesos biológicos existentes. Además, es probable que arroje nueva luz sobre los mecanismos moleculares de enfermedades que aún no se comprenden completamente. Por lo tanto, es probable que los segmentos de proteínas no caracterizados sean una gran fuente de novedad funcional relevante para descubrir una nueva biología.

1.2. Estructura y # x02013 El paradigma de función mejora la predicción de funciones

Tradicionalmente, la función de las proteínas se ha considerado críticamente dependiente de la estructura tridimensional bien definida y plegada de la cadena polipeptídica. Este paradigma clásico de estructura & # x02013función (Figura & # x200B (Figura 1 panel izquierdo) se ha basado principalmente en conceptos que explican la especificidad de las enzimas y en estructuras de proteínas plegadas que se han determinado principalmente mediante difracción de rayos X en cristales de proteínas. El concepto clásico implica que la secuencia de proteínas define la estructura, que a su vez determina la función, es decir, la función se puede inferir de la secuencia y su estructura. Incluso cuando las secuencias de proteínas divergen durante la evolución, por ejemplo, después de la duplicación de genes, el pliegue general de sus estructuras permanece Por lo tanto, la similitud estructural entre proteínas puede revelar relaciones evolutivas distantes que no son fácilmente detectables usando métodos basados ​​en secuencias. conocidos pliegues de proteínas y sus funciones, complementando así los métodos basados ​​en secuencias en un intento de llenar el intervalo de secuencias para las que no hay anotación de función. 20,21 Específicamente, la fase dos del PSI tenía como objetivo caracterizar estructuralmente proteínas y dominios proteicos de función desconocida, proporcionando a menudo la primera hipótesis sobre su función y sirviendo como punto de partida para su posterior caracterización.

Los dominios estructurados y las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) son dos clases fundamentales de bloques de construcción funcionales de proteínas. La sinergia entre regiones desordenadas y dominios estructurados aumenta la versatilidad funcional de las proteínas. Adaptado con permiso de ref (50). Copyright 2012 Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia.

1.3. La clasificación facilita aún más la predicción de funciones

Los esquemas de clasificación proporcionan una guía para la asignación sistemática de funciones a las proteínas. Generalmente, las proteínas están formadas por uno o varios dominios que pueden tener distintas funciones moleculares. Estos dominios, que se denominan dominios estructurados, a menudo se pliegan de forma independiente, hacen contactos terciarios precisos y adoptan una estructura tridimensional específica para llevar a cabo su función. Las secuencias que componen los dominios estructurados pueden organizarse en familias de secuencias homólogas, cuyos miembros probablemente compartan una relación evolutiva y una función molecular comunes. La base de datos de Pfam clasifica secuencias de proteínas conocidas y contiene casi 15 & # x02009000 familias de este tipo, para la mayoría de las cuales existe algún conocimiento sobre la función. 22 No obstante, Pfam también contiene más de 3000 familias anotadas como dominios de función desconocida o DUF. 23 Estas familias están compuestas en gran parte por proteínas hipotéticas y esperan una anotación de función. Otro poderoso ejemplo de un esquema de clasificación de proteínas es la Clasificación Estructural de Proteínas (SCOP), que proporciona un medio para agrupar proteínas con estructura conocida, basándose en sus relaciones estructurales y evolutivas. 24,25 SCOP utiliza una clasificación jerárquica que consta de cuatro niveles, (i) familia, (ii) superfamilia, (iii) pliegue y (iv) clase, con cada nivel correspondiente a diferentes grados de similitud estructural y relación evolutiva entre los miembros. Usando este esquema, la función de las estructuras o secuencias recién resueltas se puede inferir de su similitud con las clases de proteínas existentes a través de comparaciones de estructuras o secuencias, por ejemplo, según esté disponible a través de la base de datos SUPERFAMILY. 10 En esta dirección, otra iniciativa importante es Genome3D, que es un proyecto colaborativo para anotar secuencias genómicas con estructuras 3D predichas basadas en los dominios CATH 26 (Class, Architecture, Topology, Homology) y SCOP 24,25 para inferir la función de las proteínas. 27

1.4. Regiones y proteínas intrínsecamente desordenadas

Si bien muchas proteínas necesitan adoptar una estructura bien definida para llevar a cabo su función, una gran fracción del proteoma de cualquier organismo consiste en segmentos polipeptídicos que no es probable que formen una estructura tridimensional definida, pero que son funcionales. 28 & # x0221242 Estos segmentos de proteínas se denominan regiones intrínsecamente desordenadas (Figura IDR & # x200B Figura 1 1 panel derecho). 43 Debido a que los IDR generalmente carecen de aminoácidos hidrofóbicos voluminosos, no pueden formar el núcleo hidrofóbico bien organizado que constituye un dominio estructurado 31,44 y, por lo tanto, su funcionalidad surge de una manera diferente en comparación con la estructura clásica & # x02013función vista de la función globular. , proteínas estructuradas. En este marco, las secuencias de proteínas en un genoma pueden verse como modulares porque están formadas por combinaciones de regiones estructuradas y desordenadas (Figura & # x200B (panel inferior de la Figura 1). Las proteínas sin IDR se denominan proteínas estructuradas y las proteínas con Las secuencias desordenadas que no adoptan ninguna estructura terciaria se denominan proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). La mayoría de las proteínas eucarióticas están formadas por regiones estructuradas y desordenadas, y ambas son importantes para el repertorio de funciones que una proteína puede tener en una variedad de contextos celulares.43 Tradicionalmente, los IDR se consideraban segmentos pasivos en secuencias de proteínas que & # x0201clinaban & # x0201d dominios estructurados. Sin embargo, ahora está bien establecido que los IDR participan activamente en diversas funciones mediadas por proteínas. Por ejemplo, trastornos desordenados Las regiones con frecuencia están sujetas a modificaciones postraduccionales (PTM) que aumentan los estados funcionales en los que una proteína puede existir en la celda. 45,46 Además, exponen motivos peptídicos lineales cortos de aproximadamente 3 & # x0201310 aminoácidos que permiten la interacción con dominios estructurados en otras proteínas. 47,48 Estas dos características, aisladas o combinadas, permiten la interacción y el reclutamiento de diversas proteínas en el espacio y el tiempo, facilitando así la regulación de prácticamente todos los procesos celulares. 47 La prevalencia de IDR en cualquier genoma (ver, por ejemplo, la base de datos D 2 P 2, 49 Recuadro 1) en combinación con sus características únicas significa que estas regiones amplían la visión clásica del paradigma de estructura y función y, por lo tanto, de proteína función. Por tanto, las regiones funcionales de las proteínas pueden estar estructuradas o desordenadas, y es necesario considerarlas como dos clases fundamentales de bloques de construcción funcionales de proteínas. 50

Caja 1

Bases de datos de regiones y proteínas intrínsecamente desordenadas

Existen varios recursos que recopilan información experimental o computacional sobre regiones desordenadas en proteínas. La base de datos de trastornos proteicos (DisProt, http://www.disprot.org/) se desarrolló para facilitar la investigación sobre el trastorno proteico mediante la organización del conocimiento cada vez mayor sobre la caracterización experimental y las funcionalidades de los IDR y los desplazados internos. 203,400 La base de datos incluye la ubicación de las regiones desordenadas determinadas experimentalmente en una proteína y los métodos utilizados para la caracterización del trastorno. Además, cuando se conoce, las entradas enumeran la función biológica de un IDR y cómo realiza esta función. A partir de la última versión (6.02, 24 de mayo de 2013), DisProt contenía 694 entradas de IDP y 1 & # x02009539 IDR.

La base de datos IDEAL (http://www.ideal.force.cs.is.nagoya-u.ac.jp/IDEAL/) también recopila anotaciones de desplazados internos verificados experimentalmente. 388 Esta base de datos se centra en regiones que experimentan plegamiento y unión acoplados tras la interacción con otras proteínas (regiones para las que hay evidencia de un estado aislado desordenado y un estado unido ordenado), como los MoRF y ciertos motivos lineales (ver sección 3). También sugiere secuencias putativas para las que solo hay evidencia de un estado de unión ordenada, pero que se cree que sufren un plegado inducido basándose, por ejemplo, en la presencia de un elemento de plegado tras la unión verificado en un homólogo. La última versión (30 de agosto de 2013) contenía 340 proteínas con IDR anotadas, de las cuales 148 contienen elementos verificados o supuestos que sufren plegamiento al unirse.

MobiDB (http://mobidb.bio.unipd.it/) recopila datos experimentales sobre IDR de DisProt, 203 IDEAL, 388 y Protein Data Bank 147 (residuos faltantes en estructuras cristalinas y regiones estructuralmente móviles en conjuntos de RMN). 401 También almacena datos de predicción de trastornos de tres métodos. La información total sobre el trastorno se resume en un consenso ponderado. La última versión (1.2.1, 28 de agosto de 2012) contenía 26 & # x02009933 proteínas para las que existen datos experimentales sobre la presencia o ausencia de trastornos y predicciones de trastornos para 4 & # x02009662 & # x02009776 proteínas de 297 proteomas.

pE-DB (http://pedb.vib.be/) es la primera base de datos para la deposición de conjuntos estructurales (ver sección 4.2) de proteínas intrínsecamente desordenadas. 398 Las entradas contienen los datos experimentales primarios (principalmente RMN y SAXS, recuadro 2), los algoritmos utilizados en su cálculo y las coordenadas de los conjuntos estructurales, que se proporcionan como un conjunto de modelos en formato Protein Data Bank 147. El desarrollo de pE-DB está destinado a apoyar la evolución de nuevas metodologías para las descripciones estructurales del estado desordenado. pE-DB almacenó 45 conjuntos en 10 entradas al 17 de enero de 2014.

Por último, la Base de datos de predicción de proteínas desordenadas (D 2 P 2, http://d2p2.pro/) almacena las predicciones de trastornos (Cuadro 3) realizadas por nueve predictores diferentes de proteínas de genomas completamente secuenciados. 49 Además de las predicciones de trastornos, contiene información sobre MoRF (ANCHOR 386), sitios PTM (PhosphoSitePlus 402) y dominios (SCOP 24 y Pfam 22). En enero de 2014, D 2 P 2 contenía predicciones de trastornos para 10 & # x02009429 & # x02009761 secuencias en 1 & # x02009765 genomas de 1 & # x02009256 especies distintas.

1.5. La necesidad de clasificar las regiones y proteínas intrínsecamente desordenadas

Las IDR y las IDP son frecuentes en los genomas eucariotas. Por ejemplo, el 44% de los genes que codifican proteínas humanas contienen segmentos desordenados de & # x0003e30 aminoácidos de longitud 49 (datos similares se muestran en la Figura & # x200B Figura 2A). 2 A). En el genoma humano, el 6,4% de todos los genes que codifican proteínas no tienen ninguna anotación de función en su descripción en el Conjunto 1 (Figura & # x200B (Figura 2B). 2 B). Una investigación adicional utilizando la base de datos D 2 P 2 de desorden en genomas 49 reveló que la mayoría de estos genes sin anotación de función codifican al menos algún desorden (Figura & # x200B (Figura2B) 2 B) y que los genes sin anotación contienen proporcionalmente más IDR (Figura & # x200B (Figura 2C). 2 C). Dada la ausencia de restricciones estructurales, las IDR tienden a evolucionar más rápidamente que los dominios de proteínas que adoptan estructuras definidas. 51 & # x0221256 Como resultado, identificar regiones homólogas es más difícil para los IDR y los IDP que para los dominios estructurados. Esto complica la transferencia de información sobre la función entre homólogos y, por tanto, la predicción de la función de los IDR y los IDP. Además, gran parte de la anotación de proteínas se basa en información sobre familias de secuencias y dominios estructurados. Sin embargo, menos de la mitad de todos los residuos en el proteoma humano caen dentro de dichos dominios (Figura & # x200B (Figura 3). 3). No solo la mayoría de los residuos de las proteínas humanas caen fuera de los dominios, una gran fracción de estos residuos también están desordenados (Figura & # x200B (Figura 3A 3 A y B, barras de la derecha). Además, aunque se espera que los dominios SUPERFAMILY basados ​​en proteínas conocidas Las estructuras tienen muy poco desorden (Figura & # x200B (Figura3A, 3 A, barra izquierda), los dominios Pfam basados ​​en la agrupación de secuencias no contienen mucho más (Figura & # x200B (Figura3B, 3 B, barra izquierda).Estas observaciones sugieren que existe una gran cantidad de segmentos de proteínas que no se consideran mediante los métodos de anotación de proteínas convencionales, porque las secuencias de regiones desordenadas son difíciles de alinear o porque los métodos no consideran explícitamente regiones desordenadas y sin dominio de la secuencia de proteínas. En conjunto, estas consideraciones plantean la necesidad de diseñar un esquema de clasificación específicamente para regiones desordenadas en proteínas que puedan mejorar la predicción y anotación de funciones para esta importante clase de segmentos de proteínas.

El número de genes que codifican proteínas en el genoma humano con diversos grados de desorden. Histogramas del número de genes humanos con anotación (A) y sin anotación (B), agrupados por el porcentaje de residuos desordenados. (C) Una comparación de la fracción de genes humanos anotados y no anotados con diferentes cantidades de desorden. Los residuos en cada proteína se definen como desordenados cuando hay un consenso entre & # x0003e75% de los predictores en la base de datos D 2 P 2 49 en esa posición. El conjunto de genes humanos se tomó de la liberación de Ensembl 63, 1 y en cada caso se usó la proteína representativa codificada por la transcripción más larga. La anotación se tomó del campo de descripción con & # x0201copen read frame & # x0201d, & # x0201chypothetical & # x0201d, & # x0201cuncharacterized & # x0201d, y & # x0201cputative protein & # x0201d, tratado como sin anotación.

La fracción de residuos desordenados ubicados en dominios en genes codificadores de proteínas humanas: (A) residuos dentro (izquierda) y fuera (derecha) de los dominios SCOP, 24 y (B) residuos dentro (izquierda) y fuera (derecha) de los dominios Pfam (solo se consideraron los dominios Pfam curados, es decir, Pfam-A). 22 Los dominios SCOP en proteínas humanas están definidos por la base de datos SUPERFAMILY. Se tomaron 10 residuos desordenados de la base de datos D 2 P 2 49 (cuando hay un consenso entre & # x0003e75% de los predictores de desorden). El conjunto de genes humanos se tomó de la versión 63 de Ensembl. 1

En esta revisión, sintetizamos y proporcionamos una descripción general de las diversas clasificaciones de regiones y proteínas intrínsecamente desordenadas que se han propuesto en la literatura desde el inicio de los estudios sistemáticos sobre su función hace unos 15 años. Discutimos enfoques basados ​​en función, elementos funcionales, estructura, secuencia, interacciones de proteínas, evolución, regulación y propiedades biofísicas (Tabla 1). Finalmente, discutimos los recursos que están disponibles actualmente para obtener información sobre la función IDR (Tabla 2), sugerimos áreas en las que es probable que un mayor esfuerzo avance en nuestra comprensión de las funciones del trastorno proteico, y especulamos cómo las combinaciones de múltiples esquemas de clasificación existentes podrían lograr una predicción de función de alta calidad para IDR, que en última instancia debería conducir a una mejor cobertura de función y una comprensión más profunda de la función de la proteína.

Tabla 1

base para la clasificaciónclasesdescripciónejemplos
función(33,39,57,58)& # x02022cadenasentrópicasLos IDR llevan a cabo funciones que se benefician directamente de su desorden conformacional, por ejemplo, enlazadores y espaciadores flexiblesDominio de proyección MAP2, dominio PEVK de titina, RPA70, MDA5
& # x02022display sitiosLa flexibilidad de los IDR facilita la exposición de motivos y el fácil acceso a las proteínas que introducen y leen PTMp53, colas de histonas, p27, dominio inducible por la quinasa CREB
& # x02022chaperonessus propiedades vinculantes (muchos socios diferentes, asociación / disociación rápida y plegamiento al vincularse) hacen que los desplazados internos sean adecuados para las funciones de chaperónhnRNP A1, GroEL, & # x003b1-crystallin, Hsp33
& # x02022efectoresEl plegamiento tras la unión permite que los efectores modifiquen la actividad de sus proteínas asociadas.p21, p27, calpastatina, dominio de unión a GTPasa WASP
& # x02022 ensambladoresLos IDR de ensamblaje tienen grandes interfaces de unión que anclan a múltiples socios de unión y promueven la formación de complejos de proteínas de orden superiorproteínas ribosomales L5, L7, L12, L20, Tcf 3/4, dominio transactivador CREB, axina
& # x02022scavengersLos carroñeros desordenados almacenan y neutralizan pequeños ligandos.cromogranina A, glicoproteínas ricas en pro, caseínas y otras SCPP
características funcionalesmotivos lineales 47,125 & # x02022 modificación estructuralsitios de alteración conformacional de una estructura peptídicapeptidilprolil cis & # x02013trans isomerasa Pin1 sitios
& # x000a0& # x02022 escisión proteolíticasitios de eventos de procesamiento postraduccional o sitios de escisión de escisión proteolíticaCaspasa-3 / -7, separasa, taspasa1 sitios de escisión
& # x000a0& # x02022PTM eliminación / adiciónsecuencias de unión específicas que reclutan enzimas que catalizan la adición o eliminación de restos de PTMsitio de fosforilación de quinasa dependiente de ciclina, sitio de SUMOilación, sitio de N-glicosilación
& # x000a0& # x02022complejo promociónmotivos que median proteínas y interacciones proteicas importantes para la formación de complejos a menudo asociados con la transducción de señalesmotivo de unión a SH3 rico en prolina, caja de ciclina, motivo de unión a pY SH2, motivo de unión a PDZ, motivos de unión a TRAF en MAVS
& # x000a0& # x02022dockingmotivos que aumentan la especificidad y la eficiencia de los eventos de modificación al proporcionar una superficie de unión adicionalKEN box degron, sitios de acoplamiento de MAPK
& # x000a0& # x02022 segmentación o tráficoSitios de señalización que localizan proteínas dentro de orgánulos subcelulares particulares o actúan para traficar proteínas.señal de localización nuclear, motivo de caja de clatrina, motivos de tráfico del adaptador de endocitosis
características de reconocimiento molecular (MoRF) 121 & # x02022alphamotivos desordenados que forman & # x003b1-hélices al unirse al objetivop53 & # x0223c Mdm2, p53 & # x0223c RPA70, p53 & # x0223c S100B (& # x003b2 & # x003b2), RNasa E & # x0223c enolasa, inhibidor IA3 & # x0223c proteinasa & # x000a0A
& # x000a0& # x02022betamotivos desordenados que forman & # x003b2-hebras al unirse al objetivoRNasa E & # x0223c polinucleótido fosforilasa, Grim & # x0223c DIAP1, pVIc & # x0223c adenovirus 2 proteinasa
& # x000a0& # x02022iotamotivos desordenados que forman una estructura secundaria irregular al unirse al objetivop53 & # x0223c Cdk2-ciclina A, anfifisina & # x0223c & # x003b1-adaptina C
& # x000a0& # x02022complexmotivos desordenados que contienen combinaciones de diferentes tipos de estructura secundaria al unirse al objetivoamiloide & # x003b2 A4 & # x0223c X11, WASP & # x0223c Cdc42
Dominios intrínsecamente desordenados (IDD) 158,159 & # x000a0Algunos dominios de proteínas identificados mediante enfoques basados ​​en secuencias están total o ampliamente desordenados.Dominios WH2, RPEL, BH3, KID
Co-ocurrencia de dominios proteicos con regiones desordenadas 161,162 & # x000a0regiones desordenadas particulares con frecuencia coexisten en la misma secuencia con dominios de proteínas específicos& # x000a0
estructuracontinuo estructural 37 & # x000a0Las proteínas funcionan dentro de un continuo de conformaciones desordenadas de manera diferente, que se extienden desde completamente estructuradas hasta completamente desordenadas, con todo lo que se encuentra en el medio y sin límites estrictos entre los estados.& # x000a0
cuarteto de proteínas 32,34,166 & # x02022 bobina intrínsecaregiones flexibles de conformación extendida sin apenas estructura secundaria una carga neta alta las diferencia de los glóbulos desordenadosproteínas ribosomales L22, L27, 30S, S19, protimosina & # x003b1
& # x000a0& # x02022 glóbulo pre-fundidoRegiones de proteínas desordenadas con estructura secundaria residual, a menudo preparadas para doblarse en eventos de unión menor carga neta las hace más compactas que las bobinasMax, proteínas ribosómicas S12, S18, L23, L32, calsequestrina
& # x000a0& # x02022 glóbulo fundidoconformación colapsada globalmente con regiones de estructura secundaria fluctuantedominio de unión al coactivador nuclear de la proteína de unión a CREB
& # x000a0& # x02022dobladoproteínas estructuradas con una estructura tridimensional definidala mayoría de las enzimas, dominios transmembrana, hemoglobina, actina
secuenciasecuencia & # x02013relaciones de conjuntos estructurales 166,204 & # x02022 tractos polaresLos tramos de secuencia enriquecidos en aminoácidos polares a menudo forman glóbulos que generalmente carecen de preferencias significativas de estructura secundaria.Secuencias ricas en Asn y Gly, enlazadores ricos en Gln en factores de transcripción y proteínas de unión a ARN
& # x000a0& # x02022polielectrolitosLas composiciones de aminoácidos sesgadas hacia residuos cargados de un tipo de polielectrolitos fuertes (carga neta alta) forman espirales expandidasProtaminas ricas en arg, protimosina rica en Glu / Asp & # x003b1
& # x000a0& # x02022poliampolitosLas secuencias con un número aproximadamente igual de cargas positivas y negativas, las conformaciones de polianfolitos se rigen por la distribución lineal de residuos con carga opuesta, con la segregación de cargas opuestas que conducen a glóbulos, mientras que las secuencias cargadas bien mezcladas adoptan conformaciones globulares o espirales aleatorias, dependiendo de la situación. carga totalChaperonas de ARN, factores de corte y empalme, dominio de titina PEVK, prión de levadura Sup35
sabores de predicción 205 & # x02022Vpredice mejor por el predictor VL-2V, para el cual los aminoácidos hidrofóbicos son los atributos más influyentesE. coli proteínas ribosomales
& # x000a0& # x02022CVL-2C es el mejor predictor del sabor C, que tiene más residuos de histidina, metionina y alanina que los otros sabores.dominios de unión de poli y oligosacáridos
& # x000a0& # x02022Ssabor con menos histidina que los otros, mejor predicho por el predictor VL-2S, que tiene una medida de complejidad de secuencia como el atributo más importanteproteínas que facilitan la unión y la interacción
desorden & # x02013 secuencia complejidad 206 & # x000a0Los desplazados internos de diferentes clases funcionales muestran distribuciones distintas de desorden y complejidad de secuencia.proteínas con enlazadores desordenados entre dominios estructurados pueblan regiones DC compactas y desordenadas
grado general de trastorno 35,51,68,161,208,209 & # x02022fraccióncategorización de proteínas basada en la fracción de residuos que se predice que están desordenados0 & # x0201310 / 10 & # x0201330 / 30 & # x02013100% trastorno
& # x000a0& # x02022puntuación generalpuntuaciones generales de trastorno para la proteína completaPuntuación media mínima de trastorno en función del predictor
& # x000a0& # x02022 estiramientos continuospresencia o ausencia de tramos continuos de residuos desordenadostípicamente & # x0003e30 residuos
longitud de las regiones desordenadas 211 & # x02022 & # x0003e500 residuosLas proteínas que contienen regiones desordenadas de diferentes longitudes están enriquecidas para diferentes tipos de funciones.transcripción
& # x000a0& # x02022300 & # x02013500 residuos& # x000a0funciones quinasa y fosfatasa
& # x000a0& # x02022 & # x0003c50 residuos& # x000a0Unión de iones (metal), canales iónicos, actividad reguladora de GTPasa
posición de las regiones desordenadas 211 & # x02022N-terminalLas proteínas que contienen regiones desordenadas en diferentes ubicaciones de la secuencia se enriquecen para diferentes tipos de funciones.Unión al ADN, canal iónico
& # x000a0& # x02022internal& # x000a0regulador de la transcripción, unión al ADN
& # x000a0& # x02022C-terminal& # x000a0represor / activador de la transcripción, canal iónico
repeticiones en tándem 217,218 & # x02022Q / NLas regiones de proteínas ricas en glutamina y asparagina son importantes para la función celular normal y propensas a causar agregación dañinaHuntingtin, Sup35p, Ure2p, Ccr4, Pop2
& # x000a0& # x02022S / RLas repeticiones en tándem compuestas de residuos de arginina y serina están fosforiladas y desordenadas, y desempeñan un papel en el ensamblaje del espliceosoma.ASF / SF2, SRp75, SRSF1
& # x000a0& # x02022K / A / Prepeticiones en tándem compuestas de lisina, alanina y prolina función en la unión del ADN enlazador del nucleosomahistona H1
& # x000a0& # x02022F / GLos dominios desordenados con repeticiones de fenilalanina-glicina influyen en el comportamiento de activación de NPCnucleoporinas
& # x000a0& # x02022P / T / SLas regiones extensamente glicosiladas ricas en residuos de prolina, treonina y serina están involucradas en la formación de moco.mucinas
& # x000a0& # x000a0& # x02022otros& # x000a0& # x000a0
interacciones de proteínascomplejos difusos por topología 242 & # x02022 polimórficouna forma de trastorno estático, con conformaciones ligadas alternativas que cumplen funciones distintas al tener diferentes efectos sobre el compañero de unión& # x003b2-catenina & # x0223c Tcf4, NLS & # x0223c importin - & # x003b1, actina & # x0223c dominio WH2
& # x000a0& # x02022 abrazaderaformación compleja a través del plegamiento tras la unión de dos segmentos de proteínas desordenados, conectados por un enlazador que permanece desordenadoSte5 & # x0223c Fus3, miosina VI & # x0223c filamento de actina, ADN Oct-1 & # x0223c
& # x000a0& # x02022 flanqueandoformación compleja a través del plegamiento tras la unión de un segmento de proteína desordenado central, flanqueado por dos regiones que permanecen desordenadasFactor de empalme SF1 & # x0223c U2AF, péptidos ricos en prolina & # x0223c dominios SH3, p27 Kip1 & # x0223c ciclina-Cdk2
& # x000a0& # x02022randomregiones desordenadas que permanecen altamente dinámicas incluso en el estado ligadoautoensamblaje de elastina, Sic1 & # x0223c Cdc4
complejos difusos por mecanismo 176,251 & # x02022 selección conformacionalla región difusa facilita la formación de la forma de unión competente al cambiar el equilibrio conformacionalADN Max & # x0223c, ADN MeCP2 & # x0223c
& # x000a0& # x02022 modulación de flexibilidadla región difusa modula la flexibilidad de la interfaz de enlace y cambia la entropía de enlaceEts-1 y # x0223c ADN, SSB y # x0223c ADN
& # x000a0& # x02022encuadernación competitivala región difusa sirve como socio competitivo intramolecular para la superficie de unión.Inhibidor de ARNasa HMGB1 & # x0223c DNA, RNase1 & # x0223c
& # x000a0& # x02022la región difusa aumenta la concentración local de un dominio de unión de afinidad débil cerca del objetivo, o lo ancla a través de interacciones transitoriasRPA & # x0223c DNA, UPF1 & # x0223c UPF2, PC4 & # x0223c VP16
plasticidad vinculante 257 & # x02022staticcomplejos mono / polivalentes, camaleones, penetradores, abrazadorespara ver ejemplos, consulte la Figura & # x200B Figura 12 12
& # x000a0& # x02022 basado en bobina enrolladacuerdas entrelazadas, recipientes cilíndricos largos, conectores, armadura, pinzas y fórceps, pinzas, tentáculos, tiradores, apiladores& # x000a0
& # x000a0& # x02022dynamiccontactos en la nube y conjuntos de interacción de proteínas& # x000a0
evoluciónconservación de la secuencia 54 & # x02022flexibleregiones que requieren la propiedad de desorden para la funcionalidad independientemente de la secuencia exactaproteínas de señalización y reguladoras (Sky1, Bur1)
& # x000a0& # x02022constrainedregiones de trastorno conservado que también tienen secuencias de aminoácidos altamente conservadasproteínas ribosomales (Rpl5), proteínas acompañantes (Hsp90)
& # x000a0& # x02022nonconservedsin conservación del trastorno, ni de la secuencia subyacente sin distintivos funcionales clarosdominios A y B de retrotransposón Ty1 de levadura
conservación de la composición de aminoácidos 260 & # x02022HRIDR con alta conservación de residuosregulación de la transcripción y unión al ADN
& # x000a0& # x02022LRHTIDR con baja conservación de residuos pero alta conservación de la composición de aminoácidos de la regiónActividades de ATPasa y nucleasa
& # x000a0& # x02022LRLTIDR sin conservación de la secuencia ni conservación de la composición de aminoácidosproteínas de unión a iones (metálicos)
linaje y especificidad de especie 159 & # x02022procariotasLas especies de diferentes reinos de la vida parecen usar el desorden para diferentes tipos de funciones.interacciones más duraderas involucradas en la formación de complejos
& # x000a0& # x02022 eucariotas y virus& # x000a0interacciones transitorias en señalización y regulación
historia evolutiva y mecanismo de expansión repetida 61 & # x02022Tipo Irepeticiones que no mostraron diversificación de funciones después de la expansióndominio de titina PEVK, proteínas salivales ricas en prolina
& # x000a0& # x02022Tipo IIRepite que adquirió diversas funciones a través de mutación o localización diferencial dentro de la secuencia.ARN polimerasa II (CTD)
& # x000a0& # x02022Tipo IIIrepeticiones que adquirieron nuevas funciones como consecuencia de su expansiónoctarepeticiones de proteína priónica
regulaciónpatrones de expresión 208 & # x02022constitutivoLos desplazados internos codificados por transcripciones constitutivamente altamente expresadas son proteínas casi completamente desordenadas y, a menudo, ribosómicas.proteínas L ribosomales
& # x000a0& # x02022altoTranscripciones que codifican IDP que muestran altos niveles de expresión en la mayoría de los tejidos y poca especificidad tisularinhibidores de proteasa, factores de empalme, ensambladores complejos
& # x000a0& # x02022mediumestas transcripciones que codifican IDP se expresan a niveles medios, con cierta especificidad de tejidoUnión de ADN, regulación de la transcripción
& # x000a0& # x02022específico de tejidoTranscripciones que codifican IDP con expresión altamente específica de tejidoreguladores de organización celular, desmontadores complejos
& # x000a0& # x02022bajo o transitorioTranscripciones que codifican IDP que están presentes en cantidades indetectables más de la mitad de los IDP analizadosvariedad de funciones
empalme alternativo 304,305,309,312,313 & # x000a0La regulación y los patrones evolutivos de inclusión y exclusión de exones que codifican IDR pueden proporcionar información sobre si la IDR codificada funciona en la regulación e interacciones de proteínas.una región específica de tejido con un fosfosito en la proteína TJP1 en ratón, una región específica de mamífero en el regulador de empalme PTB1
cinética de degradación 315,316,318,320,321 & # x02022 aceleradores de degradaciónIDR que pueden influir y acelerar la degradación proteasomal de la proteína que lo contiene& # x000a0
& # x000a0& # x02022otrosIDR que no tienen influencia sobre la vida media de las proteínas o la aumentan, por ejemplo, debido a composiciones de secuencia que impiden la procesividad del proteasomasecuencias de baja complejidad como repeticiones de glicina-alanina y repeticiones de poliglutamina
procesamiento y secreción postraduccionales 337,340 & # x000a0Las proteínas secretadas se agotan para los desplazados internos, pero el desorden estructural es importante, por ejemplo, en las prohormonas, la matriz extracelular y la biomineralización.pre-pro-opiomelanocortina, proteínas de fibras elásticas, HERMANOS, mucinas
propiedades biofísicassolubilidad 209 & # x000a0Las características de secuencia de los desplazados internos generalmente se asocian con la solubilidad en agua, aunque algunos desplazados internos son termoestables, mientras que otros no lo son, esto probablemente esté modulado por relaciones de secuencia y conjuntos estructurales, como el grado de compactación.4E-BP1, calpastatina, CREB, p21, p27, Sp1, estatmina, WASP
transición de fase 137,353 & # x000a0ciertos IDR (como los que contienen regiones específicas de baja complejidad o motivos de interacción) pueden experimentar transiciones de fase como la formación de gotas o hidrogeles a base de proteínasmotivos multivalentes de unión a SH3 en la separación de fases, ensamblajes en forma de gránulos de proteínas de unión a ARN que contienen IDR de baja complejidad, mucinas
biomineralización 117,341 & # x000a0El trastorno estructural es común en proteínas con funciones en la biomineralización, como la formación de huesos y dientes.caseínas, osteopontina, sialoproteína ósea 2, sialofosfoproteína de dentina

Tabla 2

base para el métododescripciónmétodoSitio web
motivos linealesanotación de motivos lineales bien caracterizados, que se pueden mapear en otras secuencias de proteínasELM 125 http://elm.eu.org/
MiniMotif 126 http://mnm.engr.uconn.edu/
Identificación de motivos putativos no caracterizados en secuencias de proteínas.SLiMPrints 372 http://bioware.ucd.ie/slimprints.html
phylo-HMM 373 http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/phylo_HMM/
DiliMot 374 http://dilimot.russelllab.org/
SLiMFinder 375 http://bioware.ucd.ie/slimfinder.html
Sitios PTMrecursos de sitios PTM verificados experimentalmente, principalmente fosforilaciónPhospho.ELM 268 http://phospho.elm.eu.org/
PhosphoSite 376 http://www.phosphosite.org/
PHOSIDA 377 http://www.phosida.com/
Identificación y recopilación de motivos peptídicos que dirigen modificaciones postraduccionales.ScanSite 380 http://scansite.mit.edu/
NetPhorest 381 http://netphorest.info/
NetworKIN 382 http://networkin.info/
PhosphoNET 383 http://www.phosphonet.ca/
características de reconocimiento molecularcolección de elementos de secuencia verificados que se someten a plegado y encuadernación acopladosIDEAL 388 http://www.ideal.force.cs.is.nagoya-u.ac.jp/IDEAL/
predicción de secuencias que experimentan transiciones de desorden a ordenMoRFpred 385 http://biomine.ece.ualberta.ca/MoRFpred/
ANCLA 386 http://anchor.enzim.hu/
dominios intrínsecamente desordenadosanotación de dominios de proteínas desordenados, que pueden detectarse mediante perfiles de secuenciaPfam 22 http://pfam.sanger.ac.uk/
otropredicción de funciones de ontología genética utilizando características de la secuencia de proteínas como el trastorno intrínsecoFFPred 391 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/
anotación de funciones de regiones de proteínas desordenadas verificadas experimentalmenteDisProt 203 http://www.disprot.org/
predicciones de regiones desordenadas combinadas con información sobre MoRF, sitios PTM y dominiosD 2 P 2 & # x02009 49 http://d2p2.pro/

Figura 11.7 ¿Crees que la deriva genética se produciría más rápidamente en una isla o en tierra firme?

Figura 11.7 ¿Crees que la deriva genética se produciría más rápidamente en una isla o en tierra firme?

La deriva genética ocurriría más rápidamente en una isla o en el continente.

Introducción:

La deriva genética explica las fluctuaciones aleatorias en todos los tipos de variantes de genes en una población. Cuando aparecen variantes en un gen que se conocen como alelos, se produce una deriva genética. Estas variaciones en los alelos se miden con los cambios en las frecuencias alélicas. Estas variaciones en los alelos aumentan y disminuyen con el tiempo. Una vez que comienza la deriva genética, el alelo se pierde por una población o el alelo presente en una población. Estas dos posibilidades reducen la diversidad genética de una población.

Explicación de la solución

El área geográfica de una isla es mucho más pequeña que el continente, por lo tanto, la deriva genética ocurre más rápidamente en una isla. El continente también ha influido por otros factores en su variación en la frecuencia genética. Esto sucedió debido a la selección natural, la mutación, la migración y los cambios mediados por la deriva genética.

Por lo tanto, el tamaño de la población de especies en el continente es mucho mayor en comparación con el tamaño de una isla. Por tanto, la frecuencia genética es muy baja y difícil de rastrear. Por el contrario, las especies de las islas se cruzan entre sí y no requieren la introducción de nuevos genes. Por tanto, la deriva genética se puede rastrear fácilmente.

Por lo tanto, el área geográfica de una isla es mucho más pequeña que el continente. Por lo tanto, la deriva genética ocurre más rápidamente en una isla. Las especies de la isla se cruzan entre sí y no requieren la introducción de nuevos genes. Por tanto, la deriva genética se puede rastrear fácilmente.

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RESULTADOS

Construcción de un SKD1 mutante

Para definir la posible función de SKD1 en la ruta endocítica, construimos el mutante SKD1 E235Q . La mutación puntual E235Q se sitúa dentro de un motivo Walker-tipo B en el módulo AAA conservado entre AAA-ATPasas (ver Figura 1A) y es equivalente a la mutación dominante en Vps4p (E233Q), que causa un defecto en la clasificación de proteínas vacuolares (Finken- Eigen et al., 1997). Además, se demostró que el mutante análogo de NSF (E329Q) ejerce un efecto negativo dominante sobre el transporte intra-Golgi in vitro (Whiteheartet al., 1994). Tanto Vps4p E233Q como NSF E329Q son inactivos en la hidrólisis de ATP. Esperábamos que la sobreexpresión de SKD1 E235Q en células cultivadas ejerza un efecto negativo dominante sobre la función o funciones celulares en las que participa SKD1. Para visualizar el SKD1 mutante y de tipo salvaje expresado, sus ADNc se fusionaron al extremo C-terminal de GFP (Figura 1A).

Fig. 1. Construcción y expresión de SKD1 y SKD1 E235Q fusionados con GFP. (A) Construcciones esquemáticas de proteínas utilizadas en este estudio. GFP etiquetado en los extremos N de SKD1 y SKD1 E235Q, y se indican los motivos Walker-tipo A, Walker-tipo B y SRH en el dominio AAA. Para construir SKD1 E235Q , se introdujo una mutación de un solo punto en SKD1, que conduce al intercambio de aminoácidos del ácido glutámico a la glutamina en la posición 235 en el motivo Walker B (flecha). (B) Las células HeLa se transfectaron con GFP-SKD1 (carriles 1 y 4), GFP-SKD1 E235Q (carriles 2 y 5), o solo el vector (carriles 3 y 6). Sus extractos se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando el anticuerpo contra SKD1 (carriles 1-3) o anticuerpos contra GFP (carriles 4-6).

Utilizando el anticuerpo contra el péptido sintético correspondiente al extremo carboxilo terminal de SKD1, detectamos el SKD1 endógeno como una sola banda en la inmunotransferencia de lisados ​​de varias líneas celulares, incluidas las células HeLa, las células CHO y las células HEK293. Cuando pGFP-SKD1 o pGFP-SKD1 E235Q se transfectó a células HeLa, se confirmó la expresión transitoria después de 18 h para cada proteína de fusión por ambos anticuerpos contra SKD1 y GFP en la inmunotransferencia (Figura 1B). En las células transfectadas se sintetizaron cantidades aproximadamente iguales de GFP-SKD1 y GFP-SKD1 E235Q, 2-3 veces más que la del SKD1 endógeno. Estimamos que las proteínas de fusión se sobreexpresaron en una célula transfectada individual de 5 a 30 veces por encima del nivel endógeno con una eficiencia de transfección del 10 al 40%.

La sobreexpresión de SKD1 E235Q provoca una disminución de la superficie TfR

Para evaluar la posibilidad de que la sobreexpresión de SKD1 E235Q tenga un efecto negativo dominante sobre la endocitosis, se examinó la capacidad de las células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 o GFP-SKD1 E235Q para internalizar la Tf conjugada con rojo Texas. Después de la transfección, se permitió que las células internalizaran Texas Red-Tf durante 15 min a 37ºC. La Tf internalizada fue visible como una fluorescencia puntuada fina en las células que expresan GFP-SKD1 así como en las células no transfectadas, como se muestra en la Figura 2c. Por el contrario, las células que expresan GFP-SKD1 E235Q aparentemente no pudieron internalizar Texas Red-Tf (Figura 2d, flechas). Las células que expresan SKD1 mutante mostraron no solo un defecto en la internalización de Tf sino también una distribución característica de la proteína mutante. La mayor parte del SKD1 endógeno se distribuyó de manera difusa sobre el citoplasma (ver más abajo), al igual que su homólogo de levadura, Vps4p (Babst et al.,1997). GFP-SKD1 expresado en células HeLa también se extendió sobre el citoplasma y en el nucleoplasma (Figura 2a). (Se desconoce el motivo de la tinción nucleoplasmática. Sin embargo, no era específico de SKD1, porque se observó incluso cuando se expresaba GFP sola). Por otro lado, GFP-SKD1 E235Q mostró un patrón de puntos prominentes concentrado en el perinuclear región además del patrón difuso (Figura 2b). Se observó una distribución similar de GFP-SKD1 E235Q en todas las demás líneas celulares examinadas.

Fig. 2. Las células HeLa que sobreexpresan GFP-SKD1 E235Q no internalizan Tf. Células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 (a, c, ye) o GFP-SKD1 E235Q (b, dyf) se incubaron en presencia de Texas Red-Tf 100 nM a 37 ° C durante 15 min. A continuación, las células se fijaron para microscopía confocal de fluorescencia. (ayb) Micrografías de fluorescencia que muestran el etiquetado de proteína fusionada con GFP (cyd) micrografías de fluorescencia que muestran micrografías de contraste de interferencia diferencial de etiquetado Texas Red-Tf (eyf). Cada columna (a, c ye o b, d y f) representa el mismo campo. Las células que expresan las proteínas fusionadas con GFP se indican mediante flechas. Barra, 20 μm.

El efecto sobre la endocitosis no se limitó a la captación de Tf en las células HeLa. La internalización de LDL marcada con R18 durante 10 min a 37 ° C en células CHO también se vio afectada por la sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q (Figura 3c, flechas). Una vez más, GFP-SKD1 no mostró ningún efecto (nuestros datos no publicados).

Fig. 3. Las células CHO que sobreexpresan GFP-SKD1 E235Q no se unen ni internalizan LDL. Células CHO transfectadas con GFP-SKD1 E235Q se cultivaron en medio LPDS / F12 al 5%. Después de 18 h, las células se incubaron en presencia de 10 μg / ml de R18-LDL en el mismo medio a 37 ° C durante 10 min (ayc) oa 4 ° C durante 1 h (byd). Luego, las células se fijaron para microscopía confocal de fluorescencia. (ayb) Micrografías de fluorescencia que muestran el etiquetado de GFP-SKD1 E235Q (cyd) micrografías de fluorescencia que muestran el etiquetado de R18-LDL. Los pares de a y c y b y d representan el mismo campo. Las células que expresan GFP-SKD1 E235Q se indican mediante flechas. Barra, 20 μm.

La pérdida de la internalización del ligando nos llevó a determinar si la endocitosis de sus receptores está bloqueada o están ausentes en la superficie celular. Primero examinamos la unión de LDL a la superficie celular durante 1 ha 4 ° C. Las células HeLa que expresan GFP-SKD1 E235Q no mostraron unión de LDL a sus superficies (Figura 3d, flechas). Esto sugiere que su receptor desapareció de la superficie celular. A continuación, examinamos la expresión superficial de TfR. Las células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 E235Q se incubaron durante 1 ha 4ºC en presencia del anticuerpo monoclonal anti-TfR. Después de lavar el exceso de anticuerpo no unido, las células se fijaron y procesaron para microscopía confocal de inmunofluorescencia. La expresión superficial de TfR se observó claramente en las células no transfectadas así como en las células transfectadas con GFP-SKD1 (Figura 4c). Sorprendentemente, no se observó tinción de TfR superficial en las células transfectadas con GFP-SKD1 E235Q (Figura 4d, flechas). A partir de estas observaciones, suponemos que el deterioro de la internalización del ligando se debe a la reducción de los receptores de superficie. La expresión de GFP sola no ejerció ningún efecto sobre la internalización de Tf o LDL, o sobre la unión superficial de LDL o el anticuerpo anti-TfR (nuestros datos no publicados).

Fig. 4. TfR desaparece de la superficie de las células HeLa que sobreexpresan GFP-SKD1 E235Q. Células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 o GFP-SKD1 E235Q se incubaron en presencia del anticuerpo contra TfR a 4 ° C durante 1 h. A continuación, las células se fijaron y se incubaron con un segundo anticuerpo conjugado con Cy5 para microscopía confocal de inmunofluorescencia. (ayb) Micrografías de fluorescencia que muestran el etiquetado de proteínas fusionadas con GFP (cyd) micrografías de fluorescencia que muestran la tinción de TfR de superficie (eyf) micrografías de contraste de interferencia diferencial. Cada columna (a, c ye o b, d y f) representa el mismo campo. Las células que expresan las proteínas fusionadas con GFP se indican mediante flechas. Barra, 20 μm.

Además, cuantificamos bioquímicamente la fracción de TfR en la superficie mediante un experimento de persecución de pulsos. Bajo la eficiencia de transfección dada (10-40%), el efecto del mutante SKD1 no sería detectable si se midiera el TfR presente en todas las células. Por tanto, aprovechamos la cotransfección del mutanteSKD1 con TfR marcado con myc, porque se esperaba que el TfR ectópico se expresara junto con el SKD1 mutante en la misma población de la célula. Mediante microscopía de fluorescencia, confirmamos que las células transfectadas coexpresaban ambas proteínas ectópicas. Después de la cotransfección, las células se marcaron con [35 S] metionina / cisteína durante 15 min y luego se persiguieron durante 3 h. El TfR marcado con myc marcado se detectó mediante inmunoprecipitación usando un anticuerpo anti-myc, y la cantidad del mismo en la superficie celular se determinó mediante biotinilación de superficie. La Figura 5A muestra un representante de los resultados en tres experimentos realizados con platos duplicados. Se determinó la radiactividad en las bandas individuales y se calculó la relación de la superficie TfR etiquetada con myc al receptor total con etiqueta myc (Figura 5B). Como resultado, encontramos que la proporción se redujo significativamente en las células cotransfectadas con GFP-SKD1 E235Q, que era ~ 50% de la de las células de control. GFP-SKD1 no afectó a la relación de la TfR etiquetada con myc de superficie. En las células transfectadas con mutantes, el TfR etiquetado con myc parecía procesarse desde la forma de oligosacáridos de tipo alto en manosa (el ER forman las bandas inferiores que se ven en la Figura 5A) hasta la forma de Golgi de tipo complejo (las bandas superiores) en la proporción similar a la de las células de control. De hecho, el curso del tiempo y el nivel de conversión de la forma ER a la forma de Golgi en estas células fueron apenas distintos de los de las células de control (nuestros datos no publicados). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el SKD1 mutante no afecta ni a la glicosilación de TfR ni a su transporte a través del complejo de Golgi. Además, la sobreexpresión del SKD1 mutante no afectó a la estabilidad del TfR marcado con pulsos durante el período de persecución. Se detectó una pequeña cantidad de la banda inferior en la superficie de las células de control y las células transfectadas con mutantes (Figura 5A). Aunque la razón de esto no está clara, una pequeña fracción de la forma ER podría transportarse a la superficie celular, de acuerdo con un estudio anterior que mostró que parte del TfR no glicosilado se transporta a la superficie celular (Omary y Trowbridge, 1981).

Fig. 5. La sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q reduce la relación del TfR ectópico cotransfectado en la superficie celular al total. Las células HeLa se transfectaron solo con el vector, GFP-SKD1 E235Q o GFP-SKD1, junto con TfR marcado con myc. Las células se marcaron con [35 S] metionina / cisteína durante 15 min, se persiguieron a 37ºC o 4ºC durante 3 h, y se biotinilaron en la superficie como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. (A) TfR (T) marcado con myc inmunoprecipitado y TfR marcado con myc unido a estreptavidina-agarosa (S) analizados por SDS-PAGE. El TfR marcado con myc total y de superficie se cuantificó con un analizador de bioimagen y la expresión de superficie se normalizó por cantidades totales (B). Los valores se expresan en relación con la superficie myc-TfR en la célula cotransfectada solo con el vector e incubada a 37 ° C (Vector 37 ° C: 100%). Cada columna representa la media ± SEM de tres experimentos realizados con placas duplicadas.

El resultado anterior argumentó fuertemente que la sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q altera la distribución de TfR. Sin embargo, no pudimos excluir la posibilidad de que la distribución del TfR ectópico sobreexpresado se viera afectada por su nivel de expresión general que variaba entre las muestras, es decir, su nivel de expresión más alto podría resultar en una retención más prolongada en la superficie celular. Fue difícil controlar o normalizar los niveles de expresión en las células individuales en el experimento de expresión transitoria. Por lo tanto, para demostrar que la disminución de TfR depende de la expresión de GFP-SKD1 E235Q en las células individuales, realizamos un análisis de citometría de flujo. Para eliminar el posible efecto de la sobreexpresión de TfR, medimos el TfR endógeno en la superficie celular. Las células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 E235Q o GFP-SKD1 se incubaron durante 1 ha 4ºC con el anticuerpo anti-TfR y luego con segundos anticuerpos conjugados con PE. Las intensidades de fluorescencia de GFP y de PE en células individuales se midieron mediante citometría de flujo. Aunque el nivel de TfR superficial era casi constante independientemente del grado de expresión de GFP-SKD1 en las células transfectadas con GFP-SKD1 (Figura 6A), encontramos en las células transfectadas con mutantes una tendencia a que cuanto mayor era la GFP-SKD1 E235Q expresado, menos TfR existía en la superficie celular (Figura 6B). La correlación lineal entre el nivel de expresión de la proteína mutante y el efecto inhibidor es clara en un gráfico logarítmico de la TfR superficial media frente a cada intervalo del nivel de expresión de SKD1 mutante (Figura 6C). La población de células que exhibe el rango más alto de fluorescencia GFP-SKD1 E235Q (& gt250 U) mostró una disminución media de ~ 85% de la TfR de superficie en comparación con las células transfectadas con GFP-SKD1 o las células no transfectadas. Este resultado muestra claramente una correlación entre los niveles de expresión de GFP-SKD1 E235Q y la reducción de TfR en la superficie celular, corroborando el análisis morfológico de TfR y la captación de Tf.

Fig. 6. El análisis de citometría de flujo correlaciona la pérdida de la expresión de TfR superficial y GFP-SKD1 E235Q. Se procesaron células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 (A) o GFP-SKD1 E235Q (B) para teñir la superficie TfR como se describe en la Figura 4, excepto que se usó un segundo anticuerpo conjugado con PE. Se analizaron veinte mil células para cada transfección. Las cantidades medias de TfR de superficie se representan en C para cada subpoblación de células que expresan las proteínas fusionadas con GFP en el intervalo de intensidad indicado. Se muestra un experimento representativo repetido dos veces.

TfR y otras cargas endocíticas se acumulan en los compartimentos positivos para SKD1 E235Q

Los resultados anteriores sugirieron que la sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q puede perturbar el transporte intracelular de TfR. Esta explicación da lugar a la posibilidad de que TfR se acumule en el compartimento particular donde el SKD1 mutante inhibe el tráfico. Para abordar esta posibilidad, examinamos a continuación la distribución del receptor en el interior de las células transfectadas con GFP-SKD1 E235Q. Las células HeLa se permeabilizaron después de la fijación para hacer que el anticuerpo anti-TfR fuera accesible al antígeno tanto en el exterior como en el interior de las células. Como se indica mediante puntas de flecha en la Figura 7b, en las células HeLa no transfectadas, existía una gran fracción de TfR en la membrana plasmática, y el resto estaba en estructuras punteadas en el interior, que representan endosomas tempranos. Por otro lado, se observó una distribución distinta de TfR en las células transfectadas (Figura 7b, flechas). TfR estaba claramente ausente de nuevo en la superficie celular y se acumuló dentro de las células. El interior de TfR se colocalizó notablemente con GFP-SKD1 E235Q (Figura 7a, flechas).

Fig. 7. TfR, el dextrano endocitosado y la lámpara-1 se acumulan en los compartimentos E235Q. Las células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 E235Q se incubaron en presencia de 1 mg / ml de TRITC-dextrano a 37 ° C durante 8 h. A continuación, las células se fijaron, se permeabilizaron y se sometieron a microscopía confocal de inmunofluorescencia utilizando un segundo anticuerpo conjugado con Cy5. Cada conjunto de a – d y e – h muestra micrografías de fluorescencia del mismo campo. Se muestran el etiquetado de GFP-SKD1 E235Q (aye), la tinción de TfR (b), la tinción de lámpara-1 (f), el etiquetado de TRITC-dextrano (cyg) y una imagen combinada (dyh).Las puntas de flecha, flechas y asteriscos indican las células no transfectadas, los compartimentos E235Q en las células transfectadas con GFP-SKD1 E235Q y la lámpara-1, cuya distribución es distinta de los compartimentos E235Q, respectivamente. Barra, 20 μm.

El dextrano puede internalizarse en las células mediante endocitosis en fase líquida y administrarse a los lisosomas a través de los endosomas (Ohkuma y Poole, 1978 Dunnet al., 1994). El dextrano finalmente se acumula en los lisosomas porque es resistente a la digestión lisosomal. Para determinar si las células HeLa transfectadas con mutantes todavía pueden internalizar el dextrano conjugado con rodamina y si el compartimento que acumula GFP-SKD1 E235Q y TfR es accesible para el marcador endocítico, las células se cargaron con rodamina-dextrano durante 8 ha 37 ° C. En células sin transfección, confirmamos la distribución de rodamina-dextrano en lisosomas puntiformes que podrían marcarse con anticuerpos contra un marcador de membrana lisosomal, lámpara-1 (Figura 7, p. Ej., Punta de flechas). Las células transfectadas (indicadas por flechas) podrían internalizar rodamina dextrano (Figura 7c), y el dextrano internalizado se superpuso principalmente con las estructuras puntiformes en las que se ubicaron tanto el SKD1 mutante como el TfR (Figura 7d). Por lo tanto, razonamos que la sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q no inhibe la endocitosis del dextrano, sino que provoca su acumulación en los compartimentos positivos para GFP-SKD1 E235Q / TfR (compartimentos E235Q). Además, la mayoría de la lámpara-1 también se colocalizó en estos compartimentos (Figura 7, e – h, flechas), aunque algunos se distribuyeron en gránulos distintos de los compartimentos E235Q (Figura 7h, estrellas).

La acumulación de las cargas transportadas a través de endosomas, como TfR, dextrano y lamp-1 en los compartimentos E235Q, sugiere que la sobreexpresión del mutante SKD1 puede afectar algunos pasos del tráfico de la membrana endosomal. Para proporcionar datos funcionales que respalden esto, monitoreamos la endocitosis de EGF, que se une a su receptor en la superficie celular, luego se internaliza en los endosomas y se entrega a los lisosomas para su degradación (Yoshimori et al., 1991). Células HeLa o A-431 transfectadas con el mutante SKD1 se incubaron con Texas Red-EGF a 4 ° C durante 1 h, se lavaron y luego se dejaron absorber EGF a 37 ° C durante 30 min o 3 h. En ambas líneas celulares, el EGF internalizado fue visible como puntos brillantes a los 30 min tanto en las células no transfectadas como en las células que expresan el SKD1 mutante (Figura 8, a – d e i – l), lo que confirma que la expresión del mutante no afecta la distribución superficial y endocitosis del receptor que no se recicla, como el receptor de EGF. La incubación prolongada de 3 h resultó en una disminución significativa de la fluorescencia del EGF en las células no transfectadas, lo que indica la degradación del EGF internalizado en los lisosomas (Figura 8, e – h y m – p). Sin embargo, tanto las células HeLa como las A-431 que expresan el mutante SKD1 retuvieron una cantidad sustancial de EGF (Figura 8, flechas e – h y m – p). Se acumuló nuevamente en los compartimentos E235Q. El resultado defendió que la expresión de GFP-SKD1 E235Q provoca la inhibición del transporte desde los endosomas a los lisosomas.

Fig. 8. La degradación del EGF internalizado se inhibe en las células que expresan GFP-SKD1 E235Q. Las células HeLa (a – h) y A-431 (i – p) transfectadas con GFP-SKD1 E235Q se incubaron a 4 ° C durante 1 h en presencia de 3,3 y 0,1 μg / ml Texas Red-EGF, respectivamente. Después del lavado, las células se incubaron a 37 ° C durante 30 min (a – d e i – l) o durante 3 h (e – h y m – p). Luego, las células se fijaron para microscopía confocal de fluorescencia. Etiquetado GFP-SKD1 E235Q (a, e, i, ym), etiquetado Texas Red-EGF (b, f, j, y n), se muestran una imagen combinada (c, g, kyo) y una imagen de contraste de interferencia diferencial (d, h, i y p). Cada fila representa el mismo campo. Las células que expresan GFP-SKD1 E235Q se indican mediante flechas. Barra, 20 μm.

A continuación, examinamos la distribución de varios marcadores de orgánulos en las células transfectadas con GFP-SKD1 E235Q mediante microscopía de inmunofluorescencia. La figura 9, a-c, muestra la distribución de EEA1, un marcador establecido para los endosomas tempranos (Muet al., 1995). Como era de esperar, observamos que la tinción punteada de EEA1 se extendió en el citoplasma de las células no transfectadas (Figura 9, punta de flecha). Sorprendentemente, en las células que expresan GFP-SKD1 E235Q, la tinción de EEA1 se desplazó hacia una región perinuclear en la que se distribuyó GFP-SKD1 E235Q (Figura 9, flechas). Por lo tanto, sugerimos que la expresión del mutante SKD1 afecta la distribución de los endosomas tempranos. También teñimos las células con anticuerpos contra Rab7, otro marcador endosómico que se localiza principalmente en endosomas tardíos. Aunque la distribución de Rab7 no pareció cambiar drásticamente por la sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q, se observó cierta colocalización con la proteína mutante (Figura 9, dye). En contraste con estos marcadores de endosoma, en la microscopía de inmunofluorescencia para proteínas residentes en la luz del RE (Figura 9, j – l), un cis-La proteína de matriz de Golgi GM130 (Figura 9, g-i) y Na, K-ATPasa (Figura 9, m-o), no encontramos ni colocalización con el mutante SKD1 ni cambios notables en la distribución de los marcadores de la vía secretora en las células HeLa que expresan GFP-SKD1 E235Q en comparación con las células no transfectadas. La distribución de TGN38, que se sabe que se localiza predominantemente en el TGN en las células NRK, también fue distinta de la de GFP-SKD1 E235Q en las células NRK transfectadas (Figura 9, p – r). Curiosamente, la sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q en células NRK provocó la formación de grandes vacuolas bordeadas con el mutante SKD1 (indicado por un asterisco). En conjunto, es muy concebible que los compartimentos E235Q se deriven de la vía endocítica en lugar de la vía secretora.

Fig. 9. La sobreexpresión de GFP-SKD1 E235Q cambia la distribución del antígeno del endosoma temprano EEA1 pero no la de los marcadores de la vía secretora. Las células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 E235Q se sometieron a microscopía confocal de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra EEA1 para endosomas tempranos (a – c), Rab7 para endosomas tardíos (d – f), GM130 para el aparato de Golgi (g – i), el KDEL secuencia para el RE (j – l) y Na, K-ATPasa para las membranas plasmáticas (m – o). Para la tinción con Rab7, la permeabilización se realizó antes de la fijación. Las células NRK transfectadas también se examinaron en busca de TGN38 (p – r). Columna izquierda, micrografías de fluorescencia de la columna central de etiquetado GFP-SKD E235Q, micrografías de fluorescencia de la tinción de cada marcador utilizando una segunda columna derecha de anticuerpo conjugado con Cy5, imágenes fusionadas. Cada fila representa el mismo campo. Las flechas y puntas de flecha en a – c indican las células transfectadas con GFP-SKD1 E235Q y las células no transfectadas, respectivamente. Los asteriscos indican las vacuolas aberrantes asociadas a SKD1 mutante formadas en las células NRK. Barra, 20 μm.

Los compartimentos E235Q son vacuolas exageradas con membranas túbulo vesiculares

Una vez establecida la formación de los compartimentos perinucleares E235Q que acumulan las cargas de transporte, caracterizamos la morfología de los compartimentos a nivel ultraestructural mediante microscopía electrónica. Para este propósito, usamos células HEK293 porque la alta eficiencia de transfección (& gt50%) aumentaría la posibilidad de encontrar las células transfectadas en las secciones. Confirmamos que la sobreexpresión de SKD1 E235Q provocó un defecto en la internalización del ligando también en esta línea celular. Detectamos grandes compartimentos unidos a la membrana en el citoplasma, que nunca se vieron en las células de control (Figura 10a). Estas vacuolas aberrantes incluían membranas internas. Es de destacar que siempre asocian numerosas estructuras túbulo vesiculares. En realidad, las membranas túbulo vesiculares parecían ser continuas con las vacuolas (Figura 10b, flechas). El tamaño de los túbulos fue de 50 a 80 nm de diámetro. La morfología de la pila de Golgi (Figura 10a) y el RE aparecieron intactos. Confirmamos definitivamente tanto las vacuolas como las membranas túbulo vesiculares como endocíticas por captación previa de un marcador endocítico, HRP. Fueron fuertemente teñidos con HRP endocitosado (Figura 10, c – e). La tinción con HRP proporcionó imágenes más convincentes, lo que respalda la interconexión entre estas dos estructuras (Figura 10e, flechas).

Fig. 10. Se observan membranas endocíticas aberrantes mediante microscopía electrónica en las células transfectadas con SKD1 E235Q. (a) Las células HEK293 transfectadas con SKD1 E235Q se fijaron y observaron mediante microscopía electrónica. (b) Imagen de mayor aumento de a. (Ce) Las células HEK293 transfectadas con SKD1 E235Q se incubaron a 37ºC durante 1 h en presencia de 10 mg / ml de HRP. Las células se fijaron y se tiñeron con DAB para detectar la HRP endocitosada en microscopía electrónica. Se observó una vacuola multivesicular aberrante exagerada (V) acompañada de muchas estructuras túbulo vesiculares (T) que emergen en el citoplasma. La morfología del aparato de Golgi (G) parecía normal. Las membranas tubulo-vesiculares parecían ser continuas a la vacuola (flechas). Barra, 1 μm ..

Para evaluar si estas membranas aberrantes corresponden a los compartimentos E235Q vistos en microscopía de fluorescencia, investigamos la localización de GFP-SKD1 E235Q expresada en células HEK293 mediante un método de mejora de inmunogold y plata usando anticuerpo anti-GFP. Las partículas de oro potenciadas con plata que muestran la presencia de GFP-SKD1 E235Q se asociaron ampliamente con el lado citoplasmático de las membranas aberrantes, especialmente en la parte vacuolar (Figura 11a). Se observó poca unión de las partículas de oro mejoradas con plata a la sección en las células de control no transfectadas (nuestros datos no publicados). En marcado contraste con el SKD1 mutante, el SKD1 endógeno se localizó principalmente en el citoplasma (Figura 11b). Sin embargo, algunos de ellos se asociaron ocasionalmente con las membranas de las vesículas o algunos compartimentos similares a endosomas localizados debajo de la membrana plasmática (flechas).

Fig. 11. Microscopía inmunoelectrónica para GFP-SKD1 E235Q, el SKD1 endógeno, TfR y EEA1. Se arreglaron las células HEK293 transfectadas con GFP-SKD1 E235Q y la localización de GFP-SKD1 E235Q (a), TfR (c) y EEA1 (eh) se examinó mediante microscopía electrónica de inmuno-oro potenciada con plata usando anticuerpos contra GFP, TfR y EEA1, respectivamente. También se examinó la distribución del SKD1 endógeno en células H-4-II-E usando anticuerpos contra SKD1 (b). (d) Tinción doble de GFP-SKD1 E235Q (partículas de oro mejoradas con plata) y TfR (tinción con HRP-DAB). V, vacuola multivesicular aberrante exagerada T, estructuras túbulo vesiculares. Flechas en b, SKD1 endógeno asociado con compartimentos de membrana / vesículas puntas de flecha en f – h, EEA1 asociado con protuberancias de las vacuolas. Barra, 1 μm ..

También se encontró que TfR se acumulaba en compartimentos similares mediante microscopía electrónica de inmunoglobulina (Figura 11c). De acuerdo con los resultados de la microscopía de fluorescencia, en las células de control, se encontraron muchas partículas de oro en la membrana plasmática (nuestros datos no publicados), mientras que solo muy pocas estaban en las células transfectadas (Figura 11c). Para confirmar que los mismos compartimentos incluyen tanto TfR como GFP-SKD1 E235Q, realizamos un experimento de doble marcaje usando el anticuerpo contra GFP junto con el anticuerpo contra TfR. La Figura 11d muestra la distribución exacta de TfR (representada por tinción con HRP-DAB) en las membranas aberrantes asociadas con GFP-SKD1 E235Q (representada por partículas de oro potenciadas con plata). Finalmente, encontramos una cantidad significativa de EEA1 en las membranas de los compartimentos aberrantes (Figura 11, e – h). Las partículas de oro que indican la localización de EEA1 se detectaron tanto en la parte vacuolar como en la túbulo vesicular en algunos casos (Figura 11, gyh). Sin embargo, las partículas de oro a menudo se distribuían preferentemente en la parte túbulo vesicular (Figura 11, eyf). Las protuberancias de las vacuolas también se marcaron con frecuencia (Figura 11, f – h, puntas de flecha). A menudo observamos en inmunofluorescencia que EEA1 y GFP-SKD1 E235Q se solapaban solo parcialmente, pero estaban enredados de forma compacta (por ejemplo, Figura 9c, flecha derecha). Sobre la base de las observaciones por microscopía electrónica de inmunogold, suponemos que el patrón de tinción doble único podría reflejar la distribución preferencial de EEA1 a la parte túbulo-vesicular y las protuberancias de las vacuolas en los compartimentos E235Q.

Estas observaciones establecen que la sobreexpresión de SKD1 E235Q provoca la formación de vacuolas multivesiculares exageradas con numerosas extensiones túbulo vesiculares, que contienen HRP endocitosed, GFP-SKD1 E235Q, TfR y EEA1.

Algunos de los SKD1 endógenos se vuelven peletizables por sobreexpresión del SKD1 mutante

Finalmente, para comprender mejor la base molecular del efecto del SKD1 mutante, examinamos su influencia en la localización subcelular del SKD1 endógeno. Los homogeneizados de células HeLa se centrifugaron a 100.000 × gramo, y el sobrenadante y el sedimento resultantes se analizaron mediante análisis de inmunotransferencia. El SKD1 endógeno en las células no transfectadas se encontró principalmente en el sobrenadante (Figura 12A). Esto es bastante consistente con el estudio morfológico. Como se esperaba, se recuperó una cantidad considerable de GFP-SKD1 E235Q ectópico en el sedimento (Figura 12B). Curiosamente, la transfección de GFP-SKD1 E235Q condujo a un aumento en la cantidad de SKD1 endógeno presente en la fracción de sedimento. Debido a que solo una pequeña población de células expresaba el SKD1 mutante en el experimento de transfección transitoria, los datos indicaron que una fracción significativa del SKD1 endógeno se movió al sedimento en las células transfectadas. Por el contrario, la GFP-SKD1 ectópica se recuperó principalmente en el sobrenadante y no afectó a la localización de la SKD1 endógena (Figura 12B). Estos resultados implican que el efecto del SKD1 mutante está mediado por afectar la función normal del SKD1 endógeno.

Fig. 12. Localización subcelular de la SKD1 endógena y ectópica. (A) Un homogeneizado celular preparado a partir de células HeLa (T) se fraccionó en el sobrenadante (S) y el sedimento (P) mediante centrifugación a 100.000 × gramo. Estas fracciones se analizaron por inmunotransferencia usando anticuerpos contra SKD1, TfR (como marcador de proteína de membrana) y aldolasa (como marcador citosólico). (B) Células HeLa transfectadas con GFP-SKD1 oGFP-SKD1 E235Q se sometieron a fraccionamiento celular como se describe en A. Las fracciones se analizaron mediante inmunotransferencia usando el anticuerpo contra SKD1.


Enzimas

(20) Las enzimas son grandes estructuras de proteínas que requieren parámetros específicos para funcionar. Las desviaciones de las condiciones óptimas pueden hacer que dejen de funcionar. ¿Cuál es la temperatura corporal y el pH ideales para que sigan funcionando? Si hay una excepción a esta regla general, mencione un ejemplo y en qué se diferencia del funcionamiento dentro de las condiciones ambientales normalmente aceptadas dentro del cuerpo.

(21) Las enzimas, al igual que otros catalizadores, facilitan la ocurrencia de reacciones, pero ellas mismas no se “quitan” dentro de la reacción. Sabiendo esto, complete las siguientes ecuaciones llenando los espacios en blanco. (E significa enzima, S significa sustrato, P significa producto).

[E +? rightleftharpoons ES rightleftharpoons? + P ]

(22) Si una enzima funciona como catalizador, determine su efecto (si lo hay) en la reacción que cataliza.

(23) Determine cuál de las siguientes opciones permite la formación del complejo enzima-sustrato.

  1. Puentes de sal
  2. Interacciones dipolo-dipolo
  3. Enlaces de hidrógeno
  4. Enlaces covalentes
  5. Fuerzas de dispersión de Londres

(24) ¿Sería posible, en general, que se produjeran reacciones bioquímicas sin la ayuda de enzimas? ¿Qué tipo de reacciones bioquímicas no necesitan un catalizador?

(25) ¿Cómo funciona un inhibidor no competitivo? ¿Se considera un inhibidor no competitivo un inhibidor específico o inespecífico? Si tanto los inhibidores competitivos como los no competitivos evitan que un sustrato se una a una enzima de diferentes maneras, ¿qué otra diferencia importante los separa?

(26) Estudie el siguiente diagrama de energía para una reacción catalizada por enzimas. Etiquete Ea o & # 8710H e indique si & # 8710H es positivo o negativo.


(12) Observe la siguiente reacción y responda las preguntas siguientes.

[CH_3COOH_ <(aq)> + H_2O_ <(l)> rightleftharpoons H_3O ^ + _ <(aq)> + CH_3COO ^ -_ <(aq)> ]

  1. ¿Cuál será el efecto sobre el equilibrio si aumenta la concentración de iones hidronio?
  2. ¿Cuál será el efecto sobre el equilibrio si se reduce la concentración de acetato?
  3. Si aumenta la concentración de agua, ¿el equilibrio se desplazará hacia la izquierda o hacia la derecha?
  4. Si disminuye la concentración de ácido acético, ¿el equilibrio se desplazará hacia la izquierda o hacia la derecha?

(13) A continuación se muestra un ejemplo genérico de una reacción de equilibrio. Responda las siguientes preguntas sobre en qué dirección se desplaza el equilibrio de acuerdo con el principio de Le Chatelier & rsquos.

[A + B rightleftharpoons C + D + text]

  1. Eliminando algo de compuesto (A )
  2. Aumentando la temperatura
  3. Añadiendo más compuesto (D )
  4. Aumento de la concentración de compuesto (B )
  5. Disminuir la temperatura

(14) Algunos procesos involucran múltiples ecuaciones de equilibrio juntas. Por ejemplo, el efecto de carbonatación que crea el agua de soda involucra más de un conjunto de compuestos separados por flechas de equilibrio, como se muestra a continuación.

[CO_ <2 (g)> + H_2O_ <(l)> rightleftharpoons H_2CO_ <3 (aq)> rightleftharpoons HCO ^ -_ <3 (aq)> + H ^ + _ <(aq)> ]

una. Durante la hipoventilación, ¿qué sucede con la concentración de iones de hidrógeno?

B. Durante la hiperventilación, ¿qué sucede con la concentración de iones de hidrógeno?


Educación

El programa de Biología Molecular y Genética en EMU ofrece una licenciatura en Ciencias al completar un plan de estudios de 4 años enseñado en inglés. Los estudiantes se educan principalmente en biología molecular y varios campos de la genética. Además, los cursos incluyen otros campos de la biología como inmunología y neurociencia. La educación integral se logra mediante cursos de matemáticas, física, química, informática y otros campos integrados en el plan de estudios. En el primer año, los estudiantes son introducidos a los fundamentos de las ciencias biológicas en general y la biología molecular en particular. A continuación, los cursos especializados brindan un conocimiento profundo en varios aspectos de la genética y la biología molecular, tanto en la teoría como en la práctica a través de la experiencia de laboratorio. A los estudiantes también se les ofrecen varias opciones optativas con el fin de desarrollarse aún más de acuerdo con sus propios intereses, como en los campos de la nutrigenómica y la epidemiología genética.


INTRODUCCIÓN

La división celular correctamente orientada en tejidos tridimensionales se basa en la posición precisa del huso mitótico antes de la separación de cromátidas hermanas en anafase (Rappaport, 1971). El huso mitótico, a su vez, responde a señales espaciales, que lo orientan en relación con la corteza celular (Ahringer, 2003 Thery y Bornens, 2006 Thery et al., 2007). Gran parte de nuestra comprensión de la orientación del huso en poblaciones de tejidos proviene de estudios de división celular asimétrica en Drosophila y Caenorhabditis elegans, donde los componentes celulares se dividen de manera desigual entre las células hijas (Doe y Bowerman, 2001 Kaltschmidt y Brand, 2002 Betschinger y Knoblich, 2004 Roegiers y Enero de 2004).En tales casos, la orientación del huso se puede determinar por la forma de la célula, donde el equilibrio de fuerzas sobre los microtúbulos astrales de la corteza celular centra el huso a lo largo del eje largo. Alternativamente, se plantea la hipótesis de que las señales moleculares específicas que se localizan en la corteza a través de factores de polaridad actúan uniendo microtúbulos astrales o ejerciendo fuerzas de tracción o empuje sobre el huso.

Sin embargo, las células en epitelios polarizados simples deben dividirse simétricamente dentro del plano de la monocapa (Fleming et al., 2007) si no se logra esto, se prevé que las células crezcan fuera de la monocapa, alterando la arquitectura del tejido (Baena-Lopez et al., 2005). La división simétrica requiere que los husos mitóticos estén estrictamente orientados en el eje Z, de modo que el plano de división entre las células hijas sea perpendicular al plano de la monocapa. Sin embargo, se sabe poco sobre las señales espaciales que podrían indicar la orientación del huso en el eje Z en células que se dividen simétricamente. Los estudios que utilizaron células epiteliales de mamíferos aisladas identificaron roles para la forma celular (O'Connell y Wang, 2000) y la matriz extracelular (ECM Thery et al., 2005) en la orientación de husillos en el plano XY. La adhesión de integrina también afecta la orientación del eje Z en células no polarizadas aisladas (Toyoshima y Nishida, 2007). Pero estos informes no abordaron cómo los husos se orientan en el eje Z cuando las células polarizadas se organizan en poblaciones coherentes. Por lo tanto, en este estudio, buscamos identificar señales espaciales que orienten el huso mitótico en el eje Z para así asegurar la formación de láminas epiteliales organizadas.


Texto y figuras complementarias

Figuras complementarias 1 a 9 y tablas complementarias 1 y 2 (PDF 4306 kb)

Película complementaria 1

Una visualización en 3D de varias estructuras descritas en las figuras. La animación comienza con una representación de la superficie del mapa de densidad cryoEM, que gira alrededor de un eje doble. Las unidades estructurales que contienen las proteínas de membrana E y M mostradas en el mismo color son equivalentes por simetría icosaédrica. Las unidades estructurales de diferentes colores son casi equivalentes. Específicamente, las unidades verdes caen en los 5 ejes icosaédricos, el azul en el triple y el rojo en el doble. A esta escena le sigue una vista de cerca de un grupo en forma de rombo de seis dímeros E-M, equipados con las representaciones en forma de cinta de su modelo atómico, que gira alrededor del eje horizontal. A continuación, se promedian los tres heterotetrámeros E-M-M-E cuasi-equivalentes. Girado alrededor del eje horizontal, la mitad de este tetrámero promediado se representa como una representación de superficie sombreada y la mitad se muestra en gris semitransparente, superpuesto con las representaciones de cinta de un monómero E y un monómero M, con el mismo esquema de color que en la Figura 2. (AVI 26509 kb)

Película complementaria 2

Interacciones entre E (superficie molecular) y M (palos). Primero, una vista animada de la Figura 4b. En segundo lugar, una vista animada de la superficie molecular de E y el modelo de cinta y barra de M que comprenden la cavidad 1, como se muestra en la Figura 4c y en la Figura complementaria 8c. Un segundo bolsillo 1 en una posición relacionada con la simetría también es visible en la misma vista. En tercer lugar, una vista animada de la superficie molecular de E y el modelo de cinta y barra de M que comprenden la cavidad 2, como se muestra en la Figura 4d y la Figura complementaria 8e. La histidina en el centro de esta película es His7 de M que está involucrada en el enganche sensible al pH de E por M. Los dos átomos de nitrógeno contiguos en una protuberancia cercana arriba y a la derecha de este His7 pertenecen a His209 de E. Finalmente, una vista animada de la superficie molecular de E y el modelo de cinta y barra de M que comprenden el bolsillo 3 como se muestra en la Figura 4e y la Figura complementaria 8g. El entorno del Trp19 central de M es altamente hidrofóbico, como lo indican los tipos de átomos en la superficie molecular de E. (AVI 12159 kb)


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