Información

3.3E: Micropscopia confocal - Biología

3.3E: Micropscopia confocal - Biología



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Objetivos de aprendizaje

  • Comparar y contrastar microscopía confocal y de fluorescencia

La microscopía confocal es una técnica de imagen fluorescente no invasiva que utiliza láseres de varios colores para escanear una muestra con la ayuda de espejos de escaneo. El punto de iluminación se enfoca en la muestra mediante la lente del objetivo. El proceso de escaneo utiliza un dispositivo que está bajo el control de la computadora. Las secuencias de puntos de luz de la muestra se detectan mediante un tubo fotomultiplicador a través de un orificio. La salida se integra en una imagen y se transfiere a la pantalla de una computadora digital para su posterior análisis. La técnica emplea un corte óptico para tomar cortes en serie de la imagen. A continuación, los cortes se apilan (pila en Z) para reconstruir la imagen tridimensional de la muestra biológica. El seccionamiento óptico es útil para determinar la localización celular de los objetivos. La muestra biológica a estudiar se tiñe con anticuerpos químicamente unidos a tintes fluorescentes similar al método empleado en microscopía de fluorescencia. A diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional donde la fluorescencia se emite a lo largo de todo el cono iluminado creando una imagen nebulosa, en la microscopía confocal se agrega el orificio para permitir el paso de la luz que proviene de un punto focal específico en la muestra y no del otro. La luz detectada crea una imagen que está enfocada con la muestra original. La microscopía confocal tiene múltiples aplicaciones en microbiología, como el estudio de biopelículas y cepas de bacterias resistentes a los antibióticos. El desarrollo de microscopios confocales modernos se ha acelerado gracias a los nuevos avances en tecnología informática y de almacenamiento, sistemas láser, detectores, filtros de interferencia y fluoróforos para objetivos muy específicos.

Puntos clave

  • La microscopía confocal requiere tinción por inmunoflurescencia de muestras biológicas.
  • La microscopía confocal sirve para controlar la profundidad de campo, eliminar el fondo y recolectar secciones ópticas.
  • El uso de la microscopía confocal se ha expandido para estudiar células tanto fijas como vivas con la capacidad de cuantificar objetivos.

Términos clave

  • tubo fotomultiplicador: Un tubo de vacío que detecta luz ultravioleta, visible e infrarroja cercana y la multiplica 100 millones de veces.

Microscopía de RMN

Michal Neeman, Laurel O.Sillerud, en RMN en fisiología y biomedicina, 1994

II RESOLUCIÓN Y SENSIBILIDAD EN MICROSCOPIA DE RMN

Los principales atractivos de la microscopía de RMN son su no invasividad, la capacidad de sondear capas internas de muestras opacas a las que no se puede acceder mediante microscopía confocal y su sensibilidad a parámetros únicos como difusión, perfusión, flujo y metabolismo. La resolución de la microscopía de RMN se encuentra en el extremo inferior de los métodos de microscopía óptica, y las mejores imágenes obtenidas hasta ahora muestran una resolución plana de alrededor de 5 μm. En esta sección, analizamos las limitaciones actuales de la resolución de imágenes y las posibles vías de avance.

La codificación espacial en microscopía de RMN se obtiene marcando espines con un cambio de fase dependiente de la posición mediante la aplicación de gradientes de campo magnético ortogonal dependientes del tiempo. A diferencia de la microscopía óptica y electrónica, la resolución no está relacionada con la longitud de onda de la radiación electromagnética. La resolución depende del desplazamiento de fase más pequeño que se pueda medir. Sin embargo, la diferencia de cambio de fase entre dos puntos depende del gradiente de campo magnético aplicado. Por tanto, aumentando el gradiente del campo magnético es posible mejorar la resolución espacial.

¿Existe un límite fundamental para la resolución espacial en microscopía de RMN? La sensibilidad es el límite práctico dominante para la resolución espacial. La pérdida de resolución debida al ensanchamiento de línea por relajación, susceptibilidad de volumen y difusión impone un límite más fundamental a la resolución, pero ocurre más lentamente que la pérdida irreversible de señal debido a la reducción del tamaño de píxel y la dispersión de fase por difusión en presencia de grandes gradientes de campo (Ahn y Cho, 1989 Cho et al., 1988 McFarland, 1992 Callaghan y Eccles, 1987, 1988 Callaghan, 1990). La tasa de pérdida de señal depende en gran medida de la secuencia de pulsos experimental y generalmente es más alta para la codificación de frecuencia que para la codificación de fase. Por lo tanto, la codificación de fase 3D es probablemente el método más sensible que promete la resolución espacial más alta, aunque a costa de tiempos de adquisición más largos.

Los cálculos del límite de difusión fundamental a la resolución predijeron un valor de aproximadamente 10 μm para el agua libre (Callaghan y Eccles, 1987). Esta predicción ignoró la mejora obvia de la resolución debido a la difusión obstaculizada o restringida en la mayoría de los casos en los que la resolución tiene algún significado práctico. Este importante punto se ha planteado en varios estudios (Hyslop y Lauterbur, 1991 Zawodzinski et al., 1992). En aplicaciones biológicas y médicas nos interesa resolver estructuras que son físicamente "diferentes". Eso implicaría un cambio en la relajación, difusión o composición química, o la presencia de una membrana entre las dos estructuras. Cualquiera de estos cambios afectará inmediatamente a la imagen de una manera que mejorará la distinción entre las dos estructuras. Además, el agua intracelular tiene coeficientes de difusión significativamente más bajos que los del agua libre, lo que reduce aún más el efecto de difusión "mancha".

Dado que la sensibilidad es la limitación práctica dominante para la resolución espacial, podemos ver una tendencia a campos magnéticos más altos. La ganancia de resolución debida al aumento de la intensidad de la señal se pierde algo por el aumento de la susceptibilidad magnética. Este efecto de ensanchamiento de líneas se puede superar parcialmente mediante la aplicación de gradientes de campo magnético más altos a expensas de un desfase adicional y atenuación de la señal debido a la difusión molecular.

La aplicación de campos magnéticos elevados junto con pequeños volúmenes de muestra y pequeñas bobinas de radiofrecuencia implica que el ruido debido a la bobina receptora y la electrónica domina, en contraste con el gran ruido de la muestra en las imágenes clínicas. Por tanto, se puede obtener una mejora significativa en la relación señal / ruido reduciendo el ruido debido a la bobina de rf. Un ejemplo excelente de un posible avance en esta dirección puede ser la aplicación de bobinas rf superconductoras de alta temperatura frías. Este enfoque ya ha demostrado una mejora de 10 veces con respecto a las bobinas de cobre convencionales a temperatura ambiente (negro et al., 1993 ).

La resolución de la imagen también está limitada por la capacidad de resolver estructuras con suficiente contraste. En ese sentido, la RMN nos proporciona una amplia gama de posibles mecanismos de contraste. Contraste debido a variaciones en la densidad de giro y debido a T1 y T2 la relajación afecta a la microscopía de RMN de una manera similar a sus efectos en la RMN convencional y no se comentan aquí. Debido a los grandes gradientes de campo magnético utilizados en la microscopía de RMN y las grandes variaciones en la libertad de movimiento de los sistemas biológicos, la difusión es un mecanismo de contraste dominante y se trata en detalle en la siguiente sección. Los gradientes usados ​​en la mayoría de los estudios de microscopía de RMN de 10 a 50 G / cm causan una atenuación significativa de la intensidad de la señal en regiones de agua libre, como el espacio intersticial y las vacuolas. Las regiones con difusión de agua lenta, por otro lado, aparecen brillantes. Cabe señalar que el método de rutina para T2-imagen ponderada, a saber, larga Tmi, resulta con frecuencia también en un aumento de la ponderación de la difusión. Los efectos de T2 y la difusión puede ser opuesta y se debe tener cuidado para evitar la pérdida de contraste debido a la atenuación de la señal de especies inmóviles por T2 y pérdida de señal de especies móviles por difusión.

Sentimos que la sensibilidad de la señal de RMN a la difusión molecular ofrece una oportunidad única para estudiar sistemas en los que la difusión juega un papel vital. Para ello, analizamos en detalle los efectos de la difusión sobre la intensidad de la señal de RMN en sistemas de un solo y multicompartimiento y en sistemas con difusión anisotrópica.


Instalación de microscopía e imágenes

Ubicada en el primer piso de Langley Hall, la instalación de microscopía e imágenes del departamento está equipada con instalaciones de última generación para la manipulación de imágenes y videos digitales de microscopía óptica, confocal y electrónica e impresión de gran formato. La suite alberga microscopios electrónicos de barrido y transmisión, así como un sistema completo para microscopía confocal de barrido láser con reconstrucción de imágenes en 3D utilizando una estación de trabajo de gráficos. Esta instalación cuenta con un microscopista de tiempo completo, el Sr. Tom Harper, para ayudar a los estudiantes e investigadores con sus proyectos y está ubicada en el primer piso de Langley Hall.

El microscopio confocal y multifotónico Leica TCS SP5 es un microscopio de barrido láser de última generación que presenta un ajuste de longitud de onda de banda ancha de las longitudes de onda de emisión y detección, así como altas velocidades de barrido e imágenes de fotones múltiples. El mciroscopio es ideal para muestras vivas e imágenes fluorescentes más profundas.

El microscopio biológico de barrido láser Olympus FV1000 Fluoview es una plataforma confocal altamente evolucionada que utiliza una variedad de láseres de diodo estables y fríos, múltiples canales de imágenes de colorante simultáneas y ópticas de calidad. El microscopio proporciona una resolución excelente, alta sensibilidad y cuantificación precisa.


Departamento de Biologia

La instalación de microscopía confocal de UNCG está ubicada en SSB 353. La instalación brinda acceso a equipos de microscopía confocal y recursos de procesamiento de imágenes. El acceso es de pago por uso.

Este microscopio confocal fue comprado y respaldado por la subvención DBI-0319021 de la National Science Foundation, la subvención 2003-IDG-1011 del Centro de Biotecnología de Carolina del Norte y por fondos del Departamento de Biología y la Oficina del Provost de la UNCG.

Recursos de la instalación

Objetivos disponibles:
Posición 1: UPlanApo 10x / 0.40 infinito 8 / 0.17
Posición 2: UPlanApo 20x / 0.70 infinty 8 / 0.17
Posición 3: UPlanFL 40x / 1,30 Aceite infinito 8 / 0,17
Posición 4: PlanApo 60x / 1,40 Aceite infinito 8 / 0,17
Posición 5: Abierto
Posición 6: UPlanApo 40x / 0.85 infinito 8 0.11-0.23
Disponible para su uso a pedido:
UplanApo 60x / 1.20 Agua infinita 8 0.13-0.21

Unidades de espejo de fluorescencia UIS:
DICT, TRITC, DAPI, CY5, FITC

Láseres disponibles:
Láser de argón multilínea (457 nm, 488 nm, 514 nm)
Láser de helio neón verde (543 nm)
Láser de helio neón rojo (633 nm)
Láser de diodo azul (405 nm)

Software de análisis complementario:
Microsuite Olympus CINCO

Se encuentra disponible para su uso una estación de trabajo de imágenes separada con el software de revisión Fluoview y el software Microsuite.

Políticas

Políticas de registro para usuarios internos y externos:
Todas las políticas están sujetas a cambios sin previo aviso.

Se requiere que todos los usuarios externos realicen arreglos de pago, arreglos de reserva y presenten un acuerdo de uso antes de su primera sesión. Todo el tiempo de uso extramuros debe negociarse antes de su primera reserva.

El comité confocal negociará todos los problemas de uso.

Los usuarios internos y externos pueden registrarse para los espacios de tiempo disponibles un máximo de 48 horas antes de su uso. Regístrese para un horario poniéndose en contacto con el administrador de la instalación con su solicitud. Si no puede utilizar su tiempo reservado, informe al administrador de la instalación inmediatamente para que pueda ser eliminado del horario.

Cuando reserve los horarios disponibles, incluya su nombre, su nombre de PI (si corresponde) y un número de teléfono donde se le pueda localizar para confirmar su cita.

Todos los estudiantes e investigadores deben completar una sesión de capacitación específica para nuestras instalaciones para ser aprobados para usar la instalación, además de obtener la aprobación del administrador de la instalación antes de solicitar tiempo.

El horario de funcionamiento de las instalaciones es de lunes a viernes de 8:00 a. M. A 5:00 p. M. La instalación está cerrada durante todas las vacaciones universitarias reconocidas. Fuera del horario de atención, el acceso a las instalaciones está disponible solo para usuarios aprobados.

El cuerpo docente de UNCG y todos los investigadores externos son totalmente responsables de que sus estudiantes o el personal técnico utilicen las instalaciones.

Informe cualquier problema mecánico o técnico con el equipo de la instalación al administrador de la instalación inmediatamente a través del correo de voz. Esto se aplica a todas las emergencias que ocurren en cualquier momento. Marque (336) 256-0574 (6-0574)

Algunas cosas que se deben y no se deben hacer en la facilidad confocal general que se deben practicar:

No tocar cualquier cosa en el estante donde se encuentra el láser multilínea
Hacer ¡Cubra el alcance después de su uso! No ¡Cubra la unidad epifluorescente hasta que esté completamente fría!
No cambiar cualquier configuración del instrumento en el software que no se restablecerá al valor predeterminado después de cerrar el programa
Hacer tenga cuidado con el uso de aceite de inmersión. El 40x y el amperio 60x ubicados en las posiciones 3 y 4 del revólver son ambos objetivos de inmersión en aceite. El 40x en la posición 6 es un alto seco.
Hacer Deje encendido el ventilador de enfriamiento del láser de argón multilínea. Esto se cortará solo después de 3 minutos. Entonces el interruptor de palanca puede estar apagado.
Por favor deje las instalaciones como las encontró. Limpio y recto

Si no está seguro del uso adecuado de alguno de los equipos de la instalación de microscopía confocal, pregúntele a alguien antes de hacer una suposición costosa.

Tarifas de recursos de la instalación

Todos los usuarios externos deben hacer arreglos para la programación, facturación y pago antes de usar la instalación.
Todas las tarifas se cobran por cuarto de hora.
Las tarifas que se enumeran a continuación se cobran a las cuentas de usuario de UNCG trimestralmente a partir del 01/01/2010

Usuario Tarifa por hora Para incluir:
UNCG Interno $30.00 Instrucción y supervisión técnica limitadas
UNCG Interno $60.00 Asistencia técnica
Usuario extramuros $110.00 Instrucción y supervisión técnica limitadas
Usuario extramuros $170.00 Asistencia técnica

Reserva de recursos

Si es un usuario interno interesado en reservar tiempo, comuníquese con el administrador de la instalación para hacerlo.

Cuando reserve los horarios disponibles a través de Calcium, incluya su nombre, su nombre de PI (si corresponde) y un número de teléfono donde se le pueda localizar para confirmar su cita.

Contactos de la instalación

Jefe del Comité Confocal: John Tomkiel Dean, Ph.D.

Personal técnico / Gerente de instalaciones / Contacto de emergencia
Lee Griffin
Teléfono de la oficina (336) 334-4976


3.3E: Micropscopia confocal - Biología

La microscopía confocal ofrece varias ventajas sobre la microscopía óptica convencional, incluida la profundidad de campo controlable, la eliminación de la información desenfocada que degrada la imagen y la capacidad de recopilar secciones ópticas en serie de muestras gruesas. La clave del enfoque confocal es el uso de filtrado espacial para eliminar la luz desenfocada o los destellos en muestras que son más gruesas que el plano de enfoque. Ha habido una tremenda explosión en la popularidad de la microscopía confocal en los últimos años, debido en parte a la relativa facilidad con la que se pueden obtener imágenes de muy alta calidad a partir de muestras preparadas para microscopía óptica convencional, y a su gran número de aplicaciones en muchos áreas de interés de investigación actual. Visite los artículos, las galerías, los tutoriales interactivos y las referencias web de Molecular Expressions y Nikon MicroscopyU mediante los enlaces que se proporcionan a continuación.

Simulador de microscopio confocal de escaneo láser: quizás el avance más significativo en microscopía óptica durante la última década ha sido el refinamiento de las técnicas convencionales del microscopio confocal de escaneo láser (LSCM) utilizando sondas fluorescentes sintéticas mejoradas y proteínas diseñadas genéticamente, un espectro más amplio de fuentes de luz láser acopladas al control de filtro sintonizable acústico-óptico de alta precisión, y la combinación de paquetes de software más avanzados con computadoras modernas de alto rendimiento. Este tutorial interactivo explora las imágenes confocales de contraste de interferencia diferencial (DIC) y fluorescencia multi-láser utilizando la interfaz del software de microscopio confocal Olympus FluoView FV1000 como modelo.

Introducción a la microscopía confocal: la microscopía confocal ofrece varias ventajas sobre la microscopía óptica de campo amplio convencional, incluida la capacidad de controlar la profundidad de campo, la eliminación o reducción de la información de fondo lejos del plano focal (que conduce a la degradación de la imagen) y la capacidad de recopilar datos en serie. secciones ópticas de muestras gruesas. La clave básica del enfoque confocal es el uso de técnicas de filtrado espacial para eliminar la luz desenfocada o el deslumbramiento en muestras cuyo grosor excede el plano de enfoque inmediato. Ha habido una tremenda explosión en la popularidad de la microscopía confocal en los últimos años, debido en parte a la relativa facilidad con la que se pueden obtener imágenes de muy alta calidad a partir de muestras preparadas para microscopía de fluorescencia convencional y al creciente número de aplicaciones en biología celular. que se basan en la obtención de imágenes de células y tejidos tanto fijos como vivos. De hecho, la tecnología confocal está demostrando ser uno de los avances más importantes jamás logrados en microscopía óptica.

Conceptos básicos: los instrumentos actuales están muy evolucionados desde las primeras versiones, pero el principio de la formación de imágenes confocales propuesto por Marvin Minsky, y patentado en 1957, se emplea en todos los microscopios confocales modernos. En un microscopio de campo amplio convencional, toda la muestra se baña con luz de una fuente de mercurio o xenón, y la imagen puede verse directamente a simple vista o proyectarse en un dispositivo de captura de imágenes o película fotográfica. Por el contrario, el método de formación de imágenes en un microscopio confocal es fundamentalmente diferente. La iluminación se logra escaneando uno o más haces de luz enfocados, generalmente de un láser o una fuente de descarga de arco, a través de la muestra. Este punto de iluminación se enfoca en la muestra mediante la lente del objetivo y se escanea lateralmente utilizando algún tipo de dispositivo de escaneo controlado por computadora. Las secuencias de puntos de luz de la muestra se detectan mediante un tubo fotomultiplicador (PMT) a través de un orificio (o en algunos casos, una rendija), y la salida de la PMT se integra en una imagen y se muestra en la computadora. Aunque las muestras no teñidas se pueden ver utilizando la luz reflejada desde la muestra, por lo general se marcan con una o más sondas fluorescentes.

Modos de imagen: se utilizan varios modos de imagen diferentes en la aplicación de microscopía confocal a una amplia variedad de tipos de muestras. Todos se basan en la capacidad de la técnica para producir imágenes de alta resolución, denominadas secciones ópticas, en secuencia a través de secciones relativamente gruesas o muestras de montaje completo. Sobre la base de la sección óptica como unidad de imagen básica, se pueden recopilar datos de muestras fijas y teñidas en modos de iluminación de longitud de onda simple, doble, triple o múltiple, y las imágenes recopiladas con las diversas estrategias de iluminación y etiquetado estarán en registro con mutuamente. Es posible obtener imágenes de células vivas y secuencias de lapso de tiempo, y los métodos de procesamiento de imágenes digitales aplicados a secuencias de imágenes permiten la representación de muestras en serie z y tridimensional, así como la presentación de secuencias de tiempo de datos 3D como imágenes en cuatro dimensiones. La imagen de luz reflejada era el modo utilizado en los primeros instrumentos confocales, pero cualquiera de los modos de imagen de luz transmitida comúnmente empleados en microscopía se puede utilizar en el microscopio confocal de barrido láser.

Preparación de muestras y obtención de imágenes: los procedimientos para preparar y obtener imágenes de muestras en el microscopio confocal se derivan en gran medida de los que se han desarrollado durante muchos años para su uso con el microscopio de campo amplio convencional. En las ciencias biomédicas, una aplicación importante de la microscopía confocal implica la obtención de imágenes de células y tejidos fijos o vivos que generalmente se han marcado con una o más sondas fluorescentes. Hay disponible una gran cantidad de sondas fluorescentes que, cuando se incorporan en protocolos relativamente simples, tiñen específicamente ciertos orgánulos y estructuras celulares. Entre la plétora de sondas disponibles se encuentran los tintes que marcan los núcleos, el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico y las mitocondrias, y también tintes como las faloidinas marcadas con fluorescencia que se dirigen a la actina polimerizada en las células. Independientemente del protocolo de preparación de muestras empleado, un beneficio principal de la forma en que se lleva a cabo la microscopía confocal es la flexibilidad en la visualización y el análisis de imágenes que resulta de la recopilación simultánea de múltiples imágenes, en forma digital, en una computadora.

Fluoróforos para microscopía confocal: la microscopía confocal de barrido láser biológico se basa en gran medida en la fluorescencia como modo de imagen, principalmente debido al alto grado de sensibilidad que ofrece la técnica, junto con la capacidad de apuntar específicamente a componentes estructurales y procesos dinámicos en entornos químicamente fijos y vivos. células y tejidos. Muchas sondas fluorescentes se construyen alrededor de sustancias químicas orgánicas aromáticas sintéticas diseñadas para unirse con una macromolécula biológica (por ejemplo, una proteína o ácido nucleico) o para localizarse dentro de una región estructural específica, como el citoesqueleto, las mitocondrias, el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico y núcleo. Se emplean otras sondas para monitorear procesos dinámicos y variables ambientales localizadas, incluidas concentraciones de iones metálicos inorgánicos, pH, especies reactivas de oxígeno y potencial de membrana. Los colorantes fluorescentes también son útiles para controlar la integridad celular (vivo frente a muerto y apoptosis), endocitosis, exocitosis, fluidez de la membrana, tráfico de proteínas, transducción de señales y actividad enzimática. Además, las sondas fluorescentes se han aplicado ampliamente al mapeo genético y al análisis cromosómico en el campo de la genética molecular.

Artefactos de sangrado espectral en microscopía confocal: el sangrado espectral de la emisión de fluorescencia (a menudo denominado cruce o diafonía), que se produce debido a los anchos de banda muy amplios y los perfiles espectrales asimétricos que presentan muchos de los fluoróforos comunes, es un problema fundamental que debe abordarse en microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser y de campo amplio. El fenómeno se manifiesta habitualmente por la emisión de un fluoróforo que se detecta en el canal del fotomultiplicador o mediante la combinación de filtros reservada para un segundo fluoróforo. Los artefactos de filtración a menudo complican la interpretación de los resultados experimentales, particularmente si se está investigando la colocalización subcelular de los fluoróforos o si se necesitan mediciones cuantitativas, como en los estudios de transferencia de energía por resonancia (FRET) y fotoblanqueo (FRAP).

Elección de combinaciones de fluoróforos para microscopía confocal: al planificar múltiples protocolos de tinción de fluorescencia de etiquetas para experimentos de microscopía de fluorescencia confocal de campo amplio y escaneo láser, la elección acertada de las sondas es primordial para obtener la mejor señal objetivo y, al mismo tiempo, minimizar los artefactos de filtración. Este tutorial interactivo está diseñado para explorar la coincidencia de fluoróforos duales con líneas de excitación láser eficientes, el cálculo de los valores de superposición espectral de emisión y la determinación del nivel de sangrado aproximado que se puede esperar en función de los perfiles de longitud de onda de la ventana de detección.

Sistemas láser para microscopía óptica: los láseres comúnmente empleados en microscopía óptica son fuentes de luz monocromática de alta intensidad, que son útiles como herramientas para una variedad de técnicas que incluyen captura óptica, estudios de imágenes de por vida, recuperación de fotoblanqueo y fluorescencia de reflexión interna total. Además, los láseres también son la fuente de luz más común para escanear microscopía de fluorescencia confocal y se han utilizado, aunque con menos frecuencia, en investigaciones convencionales de fluorescencia de campo amplio.

Seguridad del láser: las dos preocupaciones principales en la operación segura del láser son la exposición al rayo y los peligros eléctricos asociados con los altos voltajes dentro del láser y su fuente de alimentación. Si bien no se conocen casos de un rayo láser que contribuya a la muerte de una persona, ha habido varios casos de muertes atribuibles al contacto con componentes relacionados con el láser de alto voltaje. Los rayos de una potencia suficientemente alta pueden quemar la piel o, en algunos casos, crear un peligro al quemar o dañar otros materiales, pero la principal preocupación con respecto al rayo láser es el daño potencial a los ojos, que son la parte del cuerpo más sensible. a la luz.

Filtros sintonizables acústico-ópticos (AOTF): varios beneficios de AOTF se combinan para mejorar en gran medida la versatilidad de la última generación de instrumentos confocales, y estos dispositivos se están volviendo cada vez más populares para el control de rangos e intensidad de longitud de onda de excitación. La característica principal que facilita casi todas las ventajas del AOTF es su capacidad para permitir que el microscopista controle la intensidad y / o la longitud de onda de la iluminación píxel por píxel mientras se mantiene una alta tasa de exploración. Esta única característica se traduce en una amplia variedad de útiles herramientas de microscopía analítica, que se mejoran aún más en flexibilidad cuando se emplea iluminación láser.

Resolución y contraste en microscopía confocal: todos los microscopios ópticos, incluidos los instrumentos convencionales de campo amplio, confocales y de dos fotones, están limitados por factores físicos fundamentales en la resolución que pueden lograr. En un sistema óptico perfecto, la resolución está limitada por la apertura numérica de los componentes ópticos y por la longitud de onda de la luz, tanto incidente como detectada. El concepto de resolución es inseparable del contraste, y se define como la separación mínima entre dos puntos que da como resultado un cierto contraste entre ellos. En un microscopio de fluorescencia real, el contraste se determina por el número de fotones recogidos de la muestra, el rango dinámico de la señal, las aberraciones ópticas del sistema de imágenes y el número de elementos de la imagen (píxeles) por unidad de área.

Fuentes de luz no coherentes para microscopía confocal: el sistema de iluminación tradicional del microscopio de campo amplio moderno utiliza una fuente de halógeno de tungsteno para la luz transmitida y una lámpara de arco corto para la excitación de la fluorescencia. Algunos investigadores han utilizado varios láseres como fuente de luz para la observación de campo amplio, pero la llegada del microscopio confocal aumentó enormemente el uso del láser en microscopía. Esta discusión revisa los méritos y limitaciones de las fuentes de luz no coherentes (o no láser) en microscopía confocal, tanto como fuentes de luz para iluminación confocal como fuentes secundarias para microscopía de campo amplio en microscopios confocales. Con frecuencia surgen dos problemas iniciales cuando se consideran los sistemas de iluminación para microscopios confocales, y estos tienen una relación directa con la elección de las fuentes de luz para un instrumento en particular.

Objetivos del microscopio confocal: para cualquier configuración de microscopio óptico convencional, el objetivo es el componente más crítico del sistema para determinar el contenido de información de la imagen. El contraste y la resolución de los detalles finos de la muestra, la profundidad dentro de la muestra a partir de la cual se puede obtener información y la extensión lateral del campo de imagen están todos determinados por el diseño del objetivo y su desempeño en las condiciones específicas empleadas para la observación. Se imponen demandas adicionales al objetivo en el escaneo de técnicas confocales, en las que este componente de imagen crucial también sirve como condensador de iluminación y, a menudo, se requiere que funcione con alta precisión en una amplia gama de longitudes de onda y en niveles de luz muy bajos sin introducir imágenes inaceptables. ruido degradante.

Sistemas de escaneo de microscopio confocal: las imágenes confocales se basan en la colección secuencial de luz de puntos de muestras individuales filtrados espacialmente, seguida del procesamiento de señales electrónicas y, en última instancia, la visualización visual como puntos de imagen correspondientes. El proceso de recolección de señales punto por punto requiere un mecanismo para escanear el haz de iluminación enfocado a través del volumen de la muestra bajo observación. Normalmente se emplean tres variaciones de exploración principales para producir imágenes de microscopio confocal. Se puede lograr una operación confocal fundamentalmente equivalente empleando una platina de muestra de traslación lateral acoplada a un haz de luz iluminadora estacionaria (escaneo de platina), un haz de luz escaneada con una platina estacionaria (escaneo de haz), o manteniendo tanto la platina como la fuente de luz estacionarias mientras escaneando la muestra con una serie de puntos de luz transmitidos a través de aberturas en un disco Nipkow giratorio. Cada técnica tiene características de desempeño que la hacen ventajosa para aplicaciones confocales específicas, pero que limitan la utilidad en otras.

Consideraciones de señal a ruido: en cualquier evaluación cuantitativa de las capacidades de obtención de imágenes que utilice técnicas de microscopía digital, incluidos los métodos confocales, se debe considerar el efecto del muestreo de la señal sobre el contraste y la resolución. Los valores de nivel de señal medidos no representan directamente el número de fotones emitidos o dispersos por la muestra, pero son proporcionales a ese número. Además, cada muestra individual de intensidad de señal es solo una aproximación del número de fotones recolectados y variará con la medición repetida. La variación, denominada ruido, imparte una incertidumbre en la cuantificación de la intensidad y, por lo tanto, en el contraste y la resolución de los datos de la imagen.

Detectores de luz electrónicos: fotomultiplicadores: en la microscopía óptica confocal de escaneo láser y fluorescencia de campo amplio moderna, la recolección y medición de la emisión secundaria recolectada por el objetivo se puede lograr mediante varias clases de detectores fotosensibles, incluidos fotomultiplicadores, fotodiodos y de estado sólido acoplados por carga. dispositivos (CCD). En la microscopía confocal, la emisión de fluorescencia se dirige a través de una apertura estenopeica colocada cerca del plano de la imagen para excluir la luz de las estructuras fluorescentes ubicadas lejos del plano focal del objetivo, reduciendo así la cantidad de luz disponible para la formación de la imagen. Como resultado, los niveles de luz extremadamente bajos que se encuentran con mayor frecuencia en la microscopía confocal requieren el uso de detectores de fotones altamente sensibles que no requieren discriminación espacial, sino que responden muy rápidamente con un alto nivel de sensibilidad a un flujo continuo de intensidad de luz variable.

Aspectos críticos de la microscopía confocal: las imágenes tridimensionales cuantitativas en microscopía de fluorescencia a menudo se complican por artefactos debidos a la preparación de la muestra, variables experimentales controlables e incontrolables o problemas de configuración con el microscopio. Este artículo, escrito por el Dr. James B. Pawley, cataloga los factores extraños más comunes que a menudo sirven para oscurecer los resultados recolectados en microscopía confocal y de campo amplio de fluorescencia. Entre los temas tratados se encuentran el sistema láser, la alineación de componentes ópticos, la ampliación del objetivo, los artefactos de blanqueo, las aberraciones, el aceite de inmersión, el grosor del cubreobjetos, la eficiencia cuántica y el medio de inclusión de la muestra.

Aberraciones en microscopía confocal multicolor: los refinamientos en el diseño han simplificado la microscopía confocal en la medida en que se ha convertido en una herramienta de investigación estándar en biología celular. Sin embargo, a medida que los microscopios confocales se han vuelto más potentes, también se han vuelto más exigentes con sus componentes ópticos. In fact, optical aberrations that cause subtle defects in image quality in widefield microscopy can have devastating effects in confocal microscopy. Unfortunately, the exacting optical requirements of confocal microscopy are often hidden by the optical system that guarantees a sharp image, even when the microscope is performing poorly. Optics manufacturers provide a wide range of microscope objectives, each designed for specific applications. This report demonstrates how the trade-offs involved in objective design can affect confocal microscopy.

Three-Color Imaging for Confocal Microscopy - The laser scanning confocal microscope ( LSCM ) is routinely used to produce digital images of single-, double-, and triple-labeled fluorescent samples. The use of red, green and blue ( RGB ) color is most informative for displaying the distribution of up to three fluorescent probes labeling a cell, where any colocalization is observed as a different additive color when the images are colorized and merged into a single three-color image. In this section we present a simplified version of a previously published method for producing three-color confocal images using the popular image manipulation program, Adobe Photoshop. In addition, several applications of the three-color merging protocol for displaying confocal images are discussed. Note that these digital methods are not confined to images produced using the LSCM and can be applied to digital images imported into Photoshop from many different sources.

Basics of Confocal Reflection Microscopy - Confocal reflection microscopy can be utilized to gather additional information from a specimen with relatively little extra effort, since the technique requires minimum specimen preparation and instrument re-configuration. In addition, information from unstained tissues is readily available with confocal reflection microscopy, as is data from tissues labeled with probes that reflect light. The method can also be utilized in combination with more common classical fluorescence techniques. Examples of the latter application are detection of unlabeled cells in a population of fluorescently labeled cells and for imaging the interactions between fluorescently labeled cells growing on opaque, patterned substrata.

Applications in Confocal Microscopy - The broad range of applications available to laser scanning confocal microscopy includes a wide variety of studies in neuroanatomy and neurophysiology, as well as morphological studies of a wide spectrum of cells and tissues. In addition, the growing use of new fluorescent proteins is rapidly expanding the number of original research reports coupling these useful tools to modern microscopic investigations. Other applications include resonance energy transfer, stem cell research, photobleaching studies, lifetime imaging, multiphoton microscopy, total internal reflection, DNA hybridization, membrane and ion probes, bioluminescent proteins, and epitope tagging. Many of these powerful techniques are described in these reviews.

Confocal Microscopy Image Gallery - The Nikon MicroscopyU Confocal Image Gallery features digital image sequences captured using a Nikon PCM-2000 confocal microscope scanning system coupled to an Eclipse E-600 upright microscope. Successive serial optical sections were recorded along the optical axis of the microscope over a range of specimen planes. These sequences are presented as interactive Java tutorials that allow the visitor to either "play" the series of sections automatically, or to utilize a slider to scroll back and forth through the images.

Olympus FluoView Laser Scanning Confocal Microscopy - The new Olympus FluoView TM FV1000 is the latest in point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscopes designed for today's intensive and demanding biological research investigations. Excellent resolution, bright and crisp optics, and high efficiency of excitation, coupled to an intuitive user interface and affordability are key characteristics of this state-of-the-art optical microscopy system.

Marvin Lee Minsky (1927-Present) - While at Harvard University, Marvin Minsky made his primary contribution to the field of optics by inventing the confocal scanning microscope. Despite the theoretical benefits of the confocal approach for biological purposes, Minsky's microscope originally generated little interest. In hindsight it has become apparent that the technology of the period limited Minsky's demonstration of the potential of the confocal approach. Yet, years later, with the advent of such applicable devices as lasers, sensitive low-noise photodetectors, and fast microcomputers with image processing capabilities, Minsky's microscopy technique has become widespread in biological research.

Interactive Java Tutorials

Laser Scanning Confocal Microscopy - (approximately a 30 second download on 28.8K modems) Several methods have been developed to overcome the poor contrast inherent with imaging thick specimens in a conventional microscope. Specimens having a moderate degree of thickness (5 to 15 microns) will produce dramatically improved images with either with confocal or deconvolution techniques. The thickest specimens (20 microns and above) will suffer from a tremendous amount of extraneous light in out-of-focus regions, and are probably best-imaged using confocal techniques. This tutorial explores imaging specimens through serial z-axis optical sections utilizing a virtual confocal microscope.

Comparing Confocal and Widefield Fluorescence Microscopy - Confocal microscopy offers several distinct advantages over traditional widefield fluorescence microscopy, including the ability to control depth of field, elimination or reduction of background information away from the focal plane (that leads to image degradation), and the capability to collect serial optical sections from thick specimens. The basic key to the confocal approach is the use of spatial filtering techniques to eliminate out-of-focus light or glare in specimens whose thickness exceeds the dimensions of the focal plane. This interactive tutorial explores and compares the differences between specimens when viewed in a confocal versus a widefield fluorescence microscope.

Colocalization of Fluorophores in Confocal Microscopy - Two or more fluorescence emission signals can often overlap in digital images recorded by confocal microscopy due to their close proximity within the specimen. This effect is known as colocalization and usually occurs when fluorescently labeled molecules bind to targets that lie in very close or identical spatial positions. This interactive tutorial explores the quantitative analysis of colocalization in a wide spectrum of specimens that were specifically designed either to demonstrate the phenomenon, or to alternatively provide examples of fluorophore targets that lack any significant degree of colocalization.

Reflected Confocal Microscopy: Integrated Circuit Inspection - Examine individual layers on the surface of integrated circuits with this interactive tutorial. Digital images for the tutorial were collected with a Nikon Optiphot C200 reflected light confocal microscope. For each sequence, a series of z-axis optical sections was recorded as the microscope was successively focused (at 1-micrometer steps) deeper within the patchwork of circuitry on the surface of the silicon chips.

Excitation Photobleaching Patterns - Multiphoton fluorescence microscopy utilizes diffraction-limited focusing by a high numerical aperture objective to localize the spatial concentration of excitation light to narrow region near the focal point. In contrast, the excitation region of a laser scanning confocal microscope is similar to that of a widefield microscope. This tutorial compares excitation-induced photobleaching patterns that occur near the focal region in both multiphoton and confocal microscopy systems.

Olympus FluoView Resource Center Interactive Java Tutorials - Explanations for many of the exceedingly complex concepts in laser scanning confocal microscopy can significantly benefit from the assistance of interactive tutorials that enable the student to obtain instanteous (real-time) response to changes in variables. The tutorials in section address the basic aspects of confocal microscopy instrumentation, laser systems, detectors, image processing, resolution, contrast, and many other aspects of the technique. All interactive Java tutorials require the Java Virtual Machine, which is available without cost as a browser plug-in from Sun Microsystems.

Referencias y recursos

Recommended Books on Confocal Microscopy - A surprisingly limited number of books dealing with various aspects of laser scanning and spinning disk confocal microscopy and related techniques are currently available from the booksellers. This section lists the FluoView Resource Center website development team's top 12 recommended books. Although the volumes listed in this section deal pricipally with confocal microscopy and related methodology, there exist a number of additional books that contain focused treatments of the materials described below, and these should also be consulted for specific techniques and timely review articles.

ZEISS Campus Confocal Microscopy Reference Library - A majority of the literature pertaining to review articles on laser scanning confocal microscopy has been published in textbooks, edited article collections, and symposia, with only an intermittent sprinkling of papers in the scientific journals. The reviews listed in this section should be available to students and investigators who have access to subscriptions through their host institutions.

Confocal Microscopy Web Resources - Laser scanning confocal microscopy ( LSCM ), a tool that has been extensively utilized for inspection of semiconductors, is now becoming a mainstream application in cell biology. The links provided in this section from the Molecular Expressions web site offer tutorials, instrumentation, application notes, technical support, glossaries, and reference materials on confocal microscopy and related techniques.

Basic Concepts in Laser Scanning Confocal Microscopy (PDF 2.8 Mb) - Laser scanning confocal microscopy has become an invaluable tool for a wide range of investigations in the biological and medical sciences for imaging thin optical sections in living and fixed specimens ranging in thickness up to 100 micrometers. Modern instruments are equipped with 3-5 laser systems controlled by high-speed acousto-optic tunable filters (AOTFs), which allow very precise regulation of wavelength and excitation intensity. Coupled with photomultipliers that have high quantum efficiency in the near-ultraviolet, visible and near-infrared spectral regions, these microscopes are capable of examining fluorescence emission ranging from 400 to 750 nanometers. Download this review article to learn more.

Kenneth W. Dunn and Exing Wang - Department of Medicine, Indiana University, School of Medicine, 1120 South Drive, FH115, Indianapolis, Indiana 46202-5116.

John M. Murray - Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, 19104.

Stephen W. Paddock , Eric J. Hazen , and Peter J. DeVries - Laboratory of Molecular Biology, Howard Hughes Medical Institute, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706.

James B. Pawley - Department of Zoology, 1117 W. Johnson Dr., University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706.

David W. Piston - Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 702 Light Hall, Nashville, Tennessee, 37212.

Kenneth R. Spring - Scientific Consultant, Lusby, Maryland, 20657.

Matthew J. Parry-Hill , Thomas J. Fellers , and Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


Características clave

See More of the Specimen

Whole mouse bladder optically cleared with iDISCO and acquired at 8192 x 8192 pixels using a 2x Plan Apo objective, effective pixel size 0.6 μm (over 5x the spatial resolution of a typical monochrome CMOS camera).
Courtesy of Dr. Gerry Apodaca, Integrative Systems Biology, Department of Medicine, University of Pittsburgh in collaboration with Dr. Alan Watson at the Center for Biological Imaging, University of Pittsburgh.

With the largest field-of-view on both inverted and upright microscope stands available (25mm diagonal), more specimens fit in one FOV with more objective lens choices than ever before.

Coupled with scanning sizes up to 8192 x 8192 pixels, sampling beyond the optical diffraction limit is possible even at low magnifications with the AX/AX R.

Using lower magnifications with longer working distances and high numerical apertures enables more flexible specimen preparations to be used, while the large FOV allows simultaneous high resolution in one image. Collect more data in every image, and at faster rates.

The AX/AX R has a 25mm diagonal FOV, much larger than other confocal instruments.

Cleared adult mouse brain acquired with 1x objective in one acquisition of one FOV*

Drosophila sp. Embryo development easily fits within the FOV using a high NA 25x SIL 1.05 NA objective*

* It would not be possible to capture this sample in one FOV or at this resolution with other commercial confocal systems

Observe with Minimal Disturbance

Laser scanning confocal imaging is principally challenging on specimen viability, as it applies focused laser illumination point by point on a sample.

The AX R’s high speed resonant scanning, which decreases the illumination time by more than 20x typical confocal scanning times, greatly reduces biases caused by merely acquiring images. Reducing the acquisition time also allows for extremely high-speed imaging (up to 720 fps @ 2048 x 16).

The result: longer imaging and/or more frequent imaging at high speed of living samples which allows capture of dynamic events, but also allows longer time-lapse imaging or significantly faster collection times on fixed specimens.

Time-lapse Z series maximum intensity projection images of a developing Drosophila embryo expressing PLC-PH::GFP (PIP2) acquired every 10 minutes for 12 hours at 2K x 1K pixels using a 25x silicone immersion objective.
Courtesy of Yang Hong Laboratory, Department of Cell Biology, University of Pittsburgh in collaboration with the Center for Biological Imaging.

Acquire More Rapidly

Confocal imaging, notoriously slow because of its point-scanning requirement for high quality 3-dimensional imaging at high resolution, is greatly changed by fast imaging with the AX R’s resonant scanning capabilities.

Utilizing 2048 x2048 pixel resonant scanning and a 25mm FOV on a large intestinal sample montage, acquiring 25 high-resolution images and merging them in under 2 minutes.

Ultrafine Detail

With a full 25mm FOV, up to 8192 x 8192 pixels, and the capability for supravideo frame rates, the AX/AX R allows for spectacular imaging with high resolution, at both low and high magnifications.

The entire range of a whole organism or system biology down to intracellular imaging is achievable on one instrument.

Mouse muscle acquired with a 25x SIL immersion objective using 2048 x 2048 pixel resonant scanning

Detectors In Tune with Labels

Maximum intensity projection of Z stack images of marmoset brain acquired with a 60x 1.27 NA water immersion objective using 2048 x 2048 pixel resonant scanning and a DUX-VB detector with user-defined emission bands.

The AX/AX R’s all new DUX-VB detector custom-tunes emission bandwidths to a library of labels and probes, and provides the freedom to fine-tune emission bands to minimize unwanted fluorescence.

Simply select the number of labels in your specimen and their catalog names. Alternatively, you can define the desired emission ranges, or even simply the emission color: the AX/AX R and NIS-Elements software does the rest, including optimizing the dichroic mirror and laser excitation choices best suited for imaging. Or, acquire hyperspectral images in up to 66 emission channels for unmixing.

Optionally, the AX/AX R’s base DUX-ST detector allows up to 12 discreet bandpasses of emission, upgradable to 18.

And all detector systems can be customized with high sensitivity and low noise GaAsP or Multi-alkali PMT detectors to provide the best detector for sensitivity and wavelength response requirements as well as budgets.

Superior optical technologies to support all confocal applications

Nikon provides a broad range of high-NA objectives with unrivaled optical quality to redefine the boundaries of confocal imaging. Options include silicone oil immersion objectives for thick live cell imaging, large-FOV low-magnification objectives and easy-to-use dry objectives. Chromatic aberrations are corrected from ultraviolet to near infrared range, enabling excellent multicolor imaging.

Maximum intensity projection of Z stack images, color-coded by depth, of vascular development in embryonic zebrafish acquired with a 10X 0.45 NA Plan Apo Lambda S objective using 1024x2048 pixel resonant scanning. Courtesy of Erika Driekorn and Dr. Beth Roman, Department of Human Genetics, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health.

Componentes opcionales

Water Immersion Dispenser

A software-controlled, automatic water dispenser enables long-term time-lapse imaging using refractive-index matching water immersion objectives in any environment, including incubation.

Automatic Correction Collar

Moves the objective correction collar to the optimum position for best resolution both remotely and by software control. Motorized collars allow users to adjust the correction collar without disturbing the specimen position, even in incubated enclosures or environmental chambers.

Multiple Modalites

Ti2-LAPP Modular Illumination System

The Ti2-E microscope supports up to 5 episcopic illumination sources, which can be used in tandem with AX/AX R confocal imaging: total internal reflection fluorescence (TIRF), point, raster or field stimulation devices, and fluorescence light sources can all be integrated onto the same microscope stand, and used in the same experiments.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)

The incident angle of a laser and corresponding penetration depth of the evanescent field can be controlled via NIS-Elements software. When multiple TIRF modules are mounted, the penetration depth can be independently set for each wavelength.

Photostimulation: Point and Raster Scanner

The XY galvano scanning unit can stimulate the desired area of a sample using laser point scanning. It allows simultaneous photostimulation and confocal imaging.

Photostimulation: Digital Micromirror Device (DMD)

The DMD module enables photoactivation of user-specified patterns rather than photoactivation of a single spot. This allows stimulation of multiple points and tracking of their behavior. The DMD module can be used with either laser illumination or less phototoxic LED illumination.


Confocal Microscopy

In Confocal Microscopy Methods and Protocols, Stephen Paddock and a highly skilled panel of experts lead the researcher using confocal techniques from the bench top, through the imaging process, to the journal page. They concisely describe all the key stages of confocal imaging-from tissue sampling methods, through the staining process, to the manipulation, presentation, and publication of the realized image. Written in a user-friendly, nontechnical style, the methods specifically cover most of the commonly used model organisms: worms, sea urchins, flies, plants, yeast, frogs, and zebrafish.

Centered in the many biological applications of the confocal microscope, the book makes possible the successful imaging of both fixed and living specimens using primarily the laser scanning confocal microscope. The powerful hands-on methods collected in Confocal Microscopy Methods and Protocols will help even the novice to produce first-class cover-quality confocal images.

"This book is an essential reference for anyone who is involved in the production of laser scanning confocal (LSCM) images. . . Exceptionally useful information on a great variety of methodologies that can be employed with LSCM is provided. . . In consideration of the vast quantity of useful information on all aspects of LSCM that is presented in this volume, and the fact that it is the first comprehensive book on this topic, it is highly recommended."-Quarterly Review of Biology

". almost every research institute has a confocal microscope, and many are developing much larger multi-user biomedical imaging facilities. The publication of this collection of methods and protocols for confocal microscopy is therefore very timely. The tips and tricks used on the various systems should prove useful to a diverse range of confocal microscope users and would be a beneficial reference volume for any imaging unit and reasonable value for money."-Cell Biology International

" This is an excellent source for anyone who wants to explore techniques in confocal microscopy. It is a practical manual with many gems that will help both new and experienced users. The principles are efficiently and accessibly explained and there is a useful chapter on fluorescent probes. there is a wealth of ideas here waiting to be applied to prokaryotic biology and many would be equally useful for simple fluorescence rather than confocal studies. I would certainly recommend it to any lab that uses fluorescence microscopy extensively."-Microbiology Today

". The texts are aimed at the biological user. for the user for whom they are intended, these essays contain a wealth of down-to-earth practical information. The book is well-produced and contains colour illustrations. "-Ultramicroscopy

". excellent information as an introductory basis for confocal microscopy."-Cellular and Molecular Biology


  • Microscope stand: Nikon Ti Eclipse inverted
  • Características:
    • Motorized XY Stage, allowing mosaic images and multi-point time-lapse imaging
    • Fast live imaging with resonant scanner and piezoelectric focus
    • Spectral unmixing of overlapping fluorophores or autofluorescence
    • Autofocus using the Perfect Focus System
    • Tokai Hit stage-top incubator and objective heater
    • Targeted photobleaching, FRAP, FRET and FLIP capability
    • 2-photon microscopy with non-descanned detector: Best for deep (up to 1mm) or long-term imaging
    • Spectral fingerprinting, multiphoton excitation fingerprinting, unmixing of multiple fluorophores/autofluorescence sources
    • 1-photon: 458, 488, 514, 561, 639 nm
    • 2-photon: Software-tunable Chameleon II laser (680-1040 nm)
    • 1-photon: Similar to DAPI, DyLight 405, CFP, FITC, YFP, mOrange, TRITC, Cy5
    • 2-photon: Compatible with most red, green and blue fluorophores
    • 1-photon: Nikon Objectives
    • 2-photon: 25x/1.10 coverslip-corrected water-immersion IR lens
    • Microscope standNikon Ti Eclipse inverted
    • Características:
      • SIM provides double the resolution of the conventional confocal microscope (lateral

      Confocal 1 - Zeiss LSM 880 with Airyscan on an Axio Observer.Z1 invert (B/K035)

      • Airyscan detector for high resolution imaging
      • fully automated microscope
      • 4 independent lasers, 6 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561, and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • ZEN 2.1 software

      Confocal 2 - Zeiss LSM 780 multiphoton on an Axio Observer.Z1 invert (B/K029)

      • fully automated microscope
      • Coherent Chameleon pulsed Ti:Sa IR Laser (range 690-1040nm)
      • 4 independent lasers, 6 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561 and 633 nm)
      • 4 external non-descanned detectors (NDD) for increased sensitivity at greater depth
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • Objective lenses ranging from 10x air through to 63x oil as well as 40x/1.1 and 63x/1.2 water immersion and 20x/1.0 and 40x/0.8 water dipping objectives ideal for deep tissue imaging
      • Solent light tight incubation chamber with full temperature and CO2 control
      • ZEN 2010 software

      Zeiss LSM 780 multiphoton

      Confocal 3 - Zeiss LSM 710 on an AxioImager.M2 (B/K034)

      • fully automated upright microscope
      • 5 independent lasers, 7 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561, 594 and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • ZEN 2011 software

      Confocal 4 - Zeiss LSM 510 meta on an Axiovert 200M (B/K037)

      • fully automated microscope
      • 3 independent lasers, 6 laser lines including (458, 477, 488, 514, 543 and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • LSM510 and ZEN 2009 software

      Zeiss LSM 510 meta invert

      Zeiss on-stage incubation system


      Confocal Microscope

      The UCA Department of Biology received a National Science Foundation grant in June 2002 to equip the facilities with a confocal laser scanning microscope (CLSM). This system provides the new means for research in biochemistry, cell biology and neuroscience for faculty and students.

      Various avenues of research include studies of the neural networks in mammalian brains, monitoring intracellular pH in cancer cells, and tracking mitochondrial proteins in yeast and slime mold. Visiting researchers from the University of Arkansas for Medical Sciences have been studying effects of ethanol on early neural development. As of spring 2005 we have started working with the “Saturdays with SEM” program to introduce high school students and educators to confocal microscopy. Here, visitors spend the day working with both the Scanning Electron Microscope (SEM) and the CLSM. During the day, they are taught the principles microscope operation and are allowed to visualize samples with the equipment.