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¿Por qué se requiere la extracción de sangre en escala de ml para realizar un análisis de sangre?

¿Por qué se requiere la extracción de sangre en escala de ml para realizar un análisis de sangre?



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Las sustancias que se encuentran en la sangre están presentes a escala microscópica y tienden a ser invisibles a simple vista. ¿Por qué se requiere un vial completo de sangre (a escala de ml) para evaluar la presencia y concentración de sustancias, dado que los equipos y pruebas modernos son cada vez más sensibles y eficientes?


Podría ser mejor considerar la tecnología de muestreo, los problemas económicos y logísticos con esta pregunta, así como la tecnología detrás de las pruebas.

Primero, algunas pruebas aún necesitarán algunos mililitros de sangre, p. Ej. recuentos de células para tipos de células específicos. Luego existe la necesidad de crear y almacenar muchos tipos diferentes de dispositivos de recolección de muestras y capacitar a los centros de recolección para que los utilicen de manera efectiva; la industria no querrá reacondicionarse por completo cada vez que cambie el requisito de volumen para los ensayos.

Básicamente, dado que el gasto de recolectar y enviar unos pocos mililitros de sangre es prácticamente idéntico a hacerlo con unos pocos microlitros de sangre, lo que ha sucedido es que los tubos se utilizan para realizar múltiples ensayos con el exceso incluido en caso de que un ensayo deba ser rehecho.

Probablemente toda esta sangre recolectada actualmente no sea necesaria en absoluto. Espero que el costo de cambiar todos los sistemas y protocolos de recolección de sangre no valga el costo de recolectar la cantidad mínima exacta de sangre necesaria. El beneficio para el paciente o el laboratorio entre la recolección de 3-5 ml de sangre y la recolección de 50 microlitros de sangre para enviarlos a análisis de laboratorio probablemente sea cercano a cero.

Tener más sangre de la que necesita no perjudica al laboratorio, ya sea en caso de que necesite repetir el ensayo o cuando necesite utilizar la muestra para más de una prueba diferente.


@shigeta trae algunas otras razones interesantes, pero creo que el principal problema con los dibujos pequeños es la falta de representatividad.

Sospecho que espera que algo "nanotainers" de Theranos reemplace las extracciones de sangre de hoy. El hecho es que la primera gota de sangre no es la más representativa de la sangre completa. Por ejemplo, las gotas de sangre extraídas de los pinchazos en los dedos no son muy similares. si difieren entre sí, es probable que difieran del resto de la sangre. Esta variabilidad es probablemente la razón por la que se demostró que las pruebas de Theranos eran bastante variables.

Para algunas pruebas, puede que no importe. Las pruebas caseras por punción digital para el azúcar en sangre en el hogar son generalmente aceptables, pero incluso aquellas vienen con una advertencia de que los resultados son algo inexactos. Para otros, tal variabilidad no se puede tolerar. Pueden ser demasiado costosos o demasiado urgentes para permitir repeticiones en caso de un resultado dudoso. Pueden dar tanto miedo que los falsos positivos deben evitarse tanto como sea posible. En todos estos casos, las pruebas deben realizarse en las condiciones más representativas.

Más sangre recolectada es esencialmente un promedio de múltiples gotas. Muchas pruebas se realizan en muestras de sangre muy pequeñas, más pequeñas que una gota. Extraer esa muestra de un charco de sangre más grande hace que las lecturas sean más representativas del resto de la sangre.


Existen cientos de pruebas, pero muchas requieren diferentes tecnologías, por lo que sacarlas todas de una sola gota es casi imposible.

Para una gran fracción de sus análisis de sangre de química / inmunología promedio, la sangre debe transportarse de una manera que mantenga la sangre líquida para que los tubos de recolección contengan anticoagulantes. El análisis implica pipetear microlitros de plasma en una cubeta donde se agregan diferentes reactivos y la reacción química resultante es monitoreada por un espectrofotómetro que detecta varios productos químicos por longitudes de onda seleccionadas que son absorbidas o emitidas. Esto requiere que se eliminen los glóbulos rojos antes de que se pueda analizar la muestra (bloquearían la luz), por lo que los tubos de recolección tienen un gel en la parte inferior y la muestra se centrifuga antes del análisis para que los glóbulos queden enterrados en el gel. y la sonda del analizador puede extraer solo el plasma transparente que se encuentra encima. Cada ensayo debe ejecutarse en su propia cubeta, de lo contrario, las reacciones se mezclarían y no sería posible cuantificar los ensayos por separado. Usando este enfoque, actualmente podemos ejecutar alrededor de 50 ensayos cuantitativos de unmlo dos de sangre. Algunos ensayos requieren diferentes tipos de tubos por diversas razones, por lo que pueden recolectar un tubo superior rojo y uno verde cuando, de lo contrario, un solo tubo sería suficiente y, como han dicho otros, se recolecta parte del exceso para permitir repeticiones o pruebas complementarias que su médico puede especificar después de ver sus resultados iniciales. Si solo recolectara una pequeña gota de sangre (como la que se usa en los medidores de glucosa en sangre portátiles), no podrá sacarla del tubo de recolección y colocarla en las cubetas de medición / reacción múltiple.

Hay tecnologías que detectan p. Ej. ADN en un chip que posiblemente podría detectar múltiples virus y cosas a partir de una sola gota de sangre, pero se basan fundamentalmente en alguna química / física subyacente que probablemente los haría de un solo uso si se conectaran a un teléfono. Si bien son muy específicos, eso tiende a hacerlos buenos para detectar cosas cualitativamente (¿tiene VIH o HEP-C?), Pero probablemente no los hará buenos para la prueba cuantitativa (¿cuánto potasio o glutamato tiene en la sangre? ). Y tratando de combinar eso con p. Ej. El recuento de glóbulos rojos y blancos es poco probable en este momento. Pero la tecnología mejora constantemente.


Niveles de plomo en sangre en niños

Proteger a los niños de la exposición al plomo es importante para una buena salud durante toda la vida. No se ha identificado un nivel seguro de plomo en sangre en niños. Se ha demostrado que incluso los niveles bajos de plomo en sangre afectan el coeficiente intelectual, la capacidad para prestar atención y el rendimiento académico. Si bien los efectos del envenenamiento por plomo son permanentes, si se detecta a tiempo, hay cosas que los padres pueden hacer ícono de pdf [PDF & ndash 234 KB] para prevenir una mayor exposición y reducir el daño a la salud de sus hijos.

El paso más importante que pueden tomar los padres, los médicos y otras personas es prevenir la exposición al plomo antes de que ocurra.

La exposición al plomo ocurre cuando un niño entra en contacto con el plomo al tocar, tragar o respirar plomo o polvo de plomo. El plomo entra rápidamente en la sangre y puede dañar la salud de su hijo. Incluso después de eliminar los peligros del plomo en el entorno de un niño o niña, los niveles en sangre no disminuyen de inmediato, por lo que la prevención es clave.

Los efectos sobre la salud de la exposición son más dañinos para los niños menores de seis años porque sus cuerpos aún se están desarrollando y creciendo rápidamente.

Los niños pequeños también tienden a meterse las manos u otros objetos que pueden estar contaminados con polvo de plomo en la boca, por lo que es más probable que estén expuestos al plomo que los niños mayores.

El plomo se absorbe rápidamente en el torrente sanguíneo. Una vez que un niño ingiere plomo, su nivel de plomo en sangre aumenta. Una vez que cesa la exposición del niño al plomo, la cantidad de plomo en la sangre disminuye gradualmente. El cuerpo del niño libera parte del plomo a través de la orina, el sudor y las heces. El plomo también se almacena en los huesos. Pueden pasar décadas para que disminuya la cantidad de plomo almacenado en los huesos.

Muchas cosas afectan la forma en que el cuerpo de un niño y de un niño maneja la exposición al plomo, que incluyen:

  • Edad niño y rsquos.
  • Estados nutricionales.
  • Cantidad de tiempo que estuvo expuesto el niño.
  • Presencia de otras condiciones de salud subyacentes.

Aunque el plomo en sangre representa solo una parte de la cantidad total de plomo presente en el cuerpo, una prueba de plomo en sangre es la mejor manera disponible para evaluar la exposición de una persona al plomo.

Un análisis de sangre es la mejor y más fácil forma de determinar si un niño ha estado expuesto al plomo. Si su hijo pudo haber estado expuesto al plomo, hable con su proveedor de atención médica sobre la posibilidad de hacerse una prueba de plomo en sangre. Según los resultados de las pruebas de plomo en sangre de su hijo y rsquos, los proveedores de atención médica pueden recomendar medidas de seguimiento y atención.

Durante una prueba de plomo en sangre, se extrae una pequeña cantidad de sangre del dedo o del brazo y se analiza la presencia de plomo. Se pueden utilizar dos tipos de análisis de sangre.

  • A prueba de punción en el dedo o capilar Suele ser el primer paso para determinar si un niño tiene niveles elevados de plomo en sangre. Si bien las pruebas de punción digital pueden proporcionar resultados rápidos, también pueden producir resultados más altos si se captura plomo en la piel en la muestra. Por esta razón, una prueba de punción en el dedo que muestra un resultado elevado suele ir seguida de una segunda prueba para confirmarlo.
  • A extracción de sangre venosa extrae sangre de la vena del niño y rsquos. Este tipo de prueba puede tardar unos días en recibir los resultados y, a menudo, se utiliza para confirmar los niveles elevados de plomo en sangre observados en la primera prueba capilar.

La mayoría de los niños que tienen algo de plomo en la sangre no presentan síntomas inmediatos obvios. Si un niño puede haber estado expuesto al plomo, los padres deben hablar con el proveedor de atención médica de su hijo sobre la posibilidad de hacerse una prueba de plomo en la sangre. Los proveedores de atención médica y la mayoría de los departamentos de salud locales pueden realizar pruebas de plomo en la sangre. Muchas pólizas de seguro privadas cubren el costo de las pruebas de plomo en la sangre. Los niños cubiertos por Medicaid pueden recibir pruebas gratuitas.

La cantidad de plomo en sangre se conoce como nivel de plomo en sangre, que se mide en microgramos de plomo por decilitro de sangre (& taza / dL). Actualmente, los CDC utilizan un valor de referencia de plomo en sangre de 5 microgramos por decilitro para identificar a los niños con niveles de plomo en sangre más altos que los niveles de la mayoría de los niños y rsquos. Este valor se basa en la población estadounidense de niños de 1 a 5 años que se encuentran en el 2.5 por ciento más alto de niños cuando se les realiza una prueba de plomo en la sangre.

Si un niño tiene un nivel elevado de plomo en sangre, su médico puede recomendar servicios de seguimiento. Estos incluyen encontrar y eliminar el plomo del entorno del niño y los niños, alimentar al niño con una dieta alta en hierro y calcio, conectar al niño con los servicios de educación temprana y programar análisis de sangre de seguimiento. La identificación temprana de niveles elevados de plomo en sangre es clave para reducir los efectos a largo plazo de la exposición al plomo. Si un niño tiene niveles muy altos de plomo en la sangre, los proveedores de atención médica pueden recomendar otros tipos de pruebas (como una radiografía) o terapia de quelación para eliminar parte del plomo de la sangre.

Para obtener más información sobre el cuidado de niños con niveles elevados de plomo en sangre, consulte Acciones recomendadas por los CDC y rsquos según el nivel de plomo en sangre.

Aunque el plomo se puede encontrar en muchos lugares en un ambiente infantil y rsquos, la exposición al plomo se puede prevenir. La clave es evitar que los niños entren en contacto con el plomo. Los padres pueden tomar medidas sencillas para hacer que sus hogares sean más seguros con el plomo. Para obtener más información, consulte Prevención del envenenamiento por plomo.


Análisis de sangre para artritis reumatoide

Los análisis de sangre para la artritis reumatoide que realizan los médicos para ayudar a diagnosticar la enfermedad incluyen:

  • Factor reumatoide (RF)
  • Péptido cíclico citrulinado (CCP)
  • Tasa de sedimentación globular (VSG)
  • Proteína C reactiva (CRP)
  • Anticuerpo antinuclear (ANA)

Ninguna de estas pruebas puede concluir singularmente que un paciente tenga artritis reumatoide. Más bien, los médicos miran los resultados combinados de todos, junto con una serie de otros criterios, incluidos los síntomas físicos y la genética, para llegar a un diagnóstico de artritis reumatoide.


Examen rectal digital (DRE)

Para un examen rectal digital (DRE), el médico inserta un dedo enguantado y lubricado en el recto para palpar cualquier bulto o área dura de la próstata que pueda ser cáncer. Como se muestra en la imagen de abajo, la próstata está justo enfrente del recto. Los cánceres de próstata a menudo comienzan en la parte posterior de la glándula y, a veces, se pueden sentir durante un examen rectal. Este examen puede ser incómodo (especialmente para hombres que tienen hemorroides), pero por lo general no es doloroso y solo toma un tiempo.


Prueba de confirmación

Algunos microorganismos distintos de los coliformes también producen ácido y gas a partir de la fermentación de lactosa. Para confirmar la presencia de coliformes, se realiza una prueba de confirmación.

  1. 3 ml de caldo de lactosa o tubo de fermentación de lactosa verde brillante,
  2. a una inclinación de agar y
  3. 3 ml de agua triptona.

Incubar los tubos de fermentación de caldo de lactosa inoculados a 37 ° C e inspeccionar la formación de gas después de 24 ± 2 horas. Si no se observa producción de gas, incube más hasta un máximo de 48 ± 3 horas para verificar la producción de gas.

Los agar inclinados deben incubarse a 37 ° C durante 24 ± 2 horas y Preparaciones teñidas con Gram hechos a partir de las inclinaciones deben examinarse microscópicamente.

La formación de gas en el caldo de lactosa y la demostración de bacilos gramnegativos no formadores de esporas en el agar correspondiente indica la presencia de un miembro del grupo de coliformes en la muestra examinada.

La ausencia de formación de gas en el caldo de lactosa o la imposibilidad de demostrar bacilos gramnegativos que no forman esporas en el agar inclinado correspondiente constituye una prueba negativa. (ausencia de coliformes en la muestra analizada).

  1. Incube el agua de triptona a (44,5 ± 0,2 ° C) durante 18-24 horas.
  2. Después de la incubación, agregue aproximadamente 0,1 ml de reactivo Kovacs y mezcle suavemente.
  3. los presencia de indolse indica por un color rojo en el reactivo de Kovacs, formando una película sobre la fase acuosa del medio.

una. Las pruebas confirmatorias positivas para indol, crecimiento y producción de gas muestran la presencia de termotolerantes. E. coli.
B. El crecimiento y la producción de gas en ausencia de indol confirman los coliformes termotolerantes.


¿Cómo trato la hipoglucemia?

Si comienza a sentir uno o más síntomas de hipoglucemia, controle su glucosa en sangre. Si su nivel de glucosa en sangre está por debajo de su objetivo o menos de 70, coma o beba 15 gramos de carbohidratos de inmediato. Ejemplos incluyen

  • cuatro tabletas de glucosa o un tubo de gel de glucosa
  • 1/2 taza (4 onzas) de jugo de frutas, que no sea bajo en calorías o bajo en azúcar *
  • 1/2 lata (4 a 6 onzas) de refresco, que no sea bajo en calorías o bajo en azúcar
  • 1 cucharada de azúcar, miel o jarabe de maíz
  • 2 cucharadas de pasas

Espere 15 minutos y vuelva a controlar su glucosa en sangre. Si su nivel de glucosa aún es bajo, coma o beba otros 15 gramos de glucosa o carbohidratos. Vuelva a controlar su glucosa en sangre después de otros 15 minutos. Repita estos pasos hasta que su nivel de glucosa vuelva a la normalidad.

Si falta más de 1 hora para su próxima comida, coma un refrigerio para mantener su nivel de glucosa en sangre dentro del rango objetivo. Pruebe galletas saladas o una pieza de fruta.

* Las personas que tienen enfermedad renal no deben beber jugo de naranja por sus 15 gramos de carbohidratos porque contiene mucho potasio. El jugo de manzana, uva o arándano son buenas opciones.

Si su nivel de glucosa en sangre está por debajo de su objetivo, tome 15 gramos de glucosa o carbohidratos de inmediato.

Tratar la hipoglucemia si toma acarbosa o miglitol

Si toma acarbosa o miglitol junto con medicamentos para la diabetes que pueden causar hipoglucemia, deberá tomar tabletas de glucosa o gel de glucosa si su nivel de glucosa en sangre es demasiado bajo. Comer o beber otras fuentes de carbohidratos no elevará su nivel de glucosa en sangre con la suficiente rapidez.


Capítulo 11: Prueba de susceptibilidad antimicrobiana de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, y steotococos neumonia

Cada laboratorio debe decidir su propio nivel de pruebas de susceptibilidad para proporcionar los datos esenciales para la toma de decisiones de salud pública relevantes para esa situación de laboratorio y rsquos. N. meningitidis, H. influenzae, y S. pneumoniae todos se han asociado con fracasos del tratamiento o de la quimioprofilaxis debido a cepas resistentes o con susceptibilidad reducida a los antimicrobianos utilizados. Además de la vigilancia de los fallos clínicos o quimioprofilácticos, la vigilancia de los patrones de susceptibilidad a los antibióticos en las cepas circulantes de N. meningitidis, H. influenzae, y S. pneumoniae forma parte del seguimiento de la aparición y propagación de cepas con susceptibilidad reducida a los antimicrobianos. Para que un laboratorio pueda asumir con éxito las responsabilidades de aislamiento, identificación y pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos, debe participar en inversiones continuas en materiales, suministros, medios, reactivos y control de calidad, junto con la capacitación periódica del personal y la evaluación de la calidad o la competencia. pruebas. Cualquier desviación de los métodos de prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos como se describe en las páginas siguientes puede invalidar los resultados de la prueba, especialmente para organismos exigentes como N. meningitidis, H. influenzae, y S. pneumoniae.

Los métodos de prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos deben realizarse como se describe de acuerdo con las pautas clínicas reconocidas internacionalmente, como las proporcionadas por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (anteriormente conocido como National Committee on Clinical Laboratory Standards & ndash NCCLS) (https: //www.clsi .org /), que es una organización educativa internacional, interdisciplinaria y sin fines de lucro que desarrolla estándares y pautas de consenso actualizados para la comunidad de atención médica anualmente. El icono externo Comit & eacute de l & rsquoAntibiogramme de la Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie (CA-SFM) y el icono externo del European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), cuyos principales objetivos son armonizar los puntos de corte para los agentes antimicrobianos en Europa, para actuar como el comité de puntos de corte para la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA) durante el registro de nuevos agentes antimicrobianos, y también para proporcionar guías clínicas reconocidas internacionalmente. Los objetivos generales de estos comités son proporcionar pautas significativas para la interpretación clínica y epidemiológica de los resultados.

Existe una variedad de métodos mediante los cuales se puede determinar la susceptibilidad antimicrobiana de un patógeno bacteriano, que comúnmente incluyen difusión en disco, dilución en agar o microdilución en caldo y difusión en tiras de gradiente antimicrobiano (14). El método de difusión en disco presentado en este capítulo es una modificación de la técnica de Kirby-Bauer que ha sido cuidadosamente estandarizada por CLSI y otros. Si se realiza con precisión de acuerdo con el siguiente protocolo, este método producirá datos que pueden predecir de manera confiable la en vivo eficacia del fármaco en cuestión. Aunque la difusión por disco proporcionará información para la mayoría de los agentes antimicrobianos con respecto a la interpretación de una cepa como susceptible, intermedia o resistente, no proporciona información precisa sobre la concentración inhibitoria mínima (MIC). Además, la difusión por disco no produce resultados fiables con algunas combinaciones de antibiótico / organismo, como para la penicilina G en N. meningitidis y S. pneumoniae. Por lo tanto, este manual de laboratorio también recomienda el uso de la difusión en tiras de gradiente de antimicrobianos para recopilar datos sobre la CMI de los agentes antimicrobianos.

Las tiras de gradiente antimicrobiano son un método de prueba de susceptibilidad antimicrobiana que es técnicamente tan simple de realizar como la difusión en disco y produce resultados semicuantitativos que se miden en microgramos por mililitro (& microg / ml). Es específico del fármaco, consiste en una delgada tira plástica en gradiente de antibiótico que se aplica a una placa de agar inoculada y es conveniente porque aplica los principios de difusión en agar para realizar pruebas semicuantitativas. El gradiente de concentración continuo de antibiótico seco estabilizado es equivalente a 15 diluciones dobles mediante un procedimiento de CMI de referencia convencional como lo sugiere CLSI. Las tiras reactivas de gradiente antimicrobiano se han comparado y evaluado junto con los métodos de prueba de susceptibilidad por dilución en caldo y en agar recomendados por CLSI. Los informes autorizados indican que un

Existe una correlación del 85-100% entre las determinaciones de CMI convencionales aceptadas y la CIM determinada por el procedimiento de la tira reactiva para una variedad de combinaciones de organismo y fármaco (2, 3, 9, 10). Algunos estudios han citado las CIM de las tiras reactivas de gradiente como aproximadamente una dilución más alta que las CIM determinadas por métodos de dilución estándar.

La prueba de CIM también se puede realizar mediante dilución, pero debido a que la dilución en agar y la microdilución en caldo son costosas y técnicamente complejas, este manual recomienda que los países que actualmente no realizan pruebas de CIM mediante métodos de dilución deben utilizar un laboratorio de referencia en lugar de desarrollar el ensayo en el país. Alternativamente, si los recursos están disponibles, los laboratorios pueden comprar paneles MIC congelados disponibles comercialmente y seguir las instrucciones del fabricante y rsquos para realizar la prueba MIC. Es importante tener en cuenta que la precisión y reproducibilidad de estas pruebas dependen de seguir los procedimientos y condiciones de prueba estándar de control de calidad / garantía de calidad (QC / QA) en los laboratorios de forma continua.

Esta guía describe los medios óptimos, el inóculo, los agentes antimicrobianos para analizar, las condiciones de incubación y la interpretación de los resultados para N. meningitidis, H. influenzae, y S. pneumoniae presentado por CLSI, CA-SFM y EUCAST. En varios casos, el diámetro de la zona y los estándares de interpretación de MIC difieren para el mismo antimicrobiano entre CLSI, CA-SFM y EUCAST. Estas diferencias surgen por muchas razones, que incluyen: diferentes bases de datos de datos de susceptibilidad, diferencias en la interpretación de esos datos, diferencias tanto en los antimicrobianos como en las dosis utilizadas en diferentes partes del mundo y las políticas de salud pública. Los estándares de interpretación presentados por las 3 organizaciones deben tratarse como pautas y pueden modificarse para satisfacer las necesidades de la región. Incumbe al laboratorio y al sistema de salud pública permanecer alerta ante los fracasos del tratamiento clínico y las tendencias de disminución de la susceptibilidad a los antimicrobianos, independientemente del conjunto de estándares de interpretación que se utilicen.

  1. Recomendaciones del programa de susceptibilidad a los antimicrobianos Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos son una actividad intensiva en recursos que requiere una cantidad significativa de mano de obra, técnicos bien capacitados y procesos de control de calidad que deben mantenerse. Cada laboratorio que esté considerando iniciar un programa de pruebas debe realizar un análisis de costo-beneficio para determinar la cantidad de pruebas que se pueden realizar sin afectar negativamente otras funciones del laboratorio. Si bien la situación de prueba óptima sería realizar pruebas de susceptibilidad en todos los aislamientos entrantes, es poco probable que sea práctico o económico. Las pruebas de susceptibilidad de un subconjunto de aislamientos endémicos y epidémicos (es decir, cada décimo aislado) proporcionarían datos útiles. Durante una epidemia causada por una cepa clonal, las pruebas cada 25 cepas pueden ser suficientes. Estos números son arbitrarios y pueden tener que revisarse a medida que cambia la situación epidemiológica. Si se encuentra que una cepa es resistente a un antimicrobiano dado, sería prudente analizar más cepas asociadas epidemiológicamente con la cepa resistente. Es imperativo que el monitoreo de fallas clínicas y / o de quimioprofilaxis se realice independientemente de la cantidad de pruebas de susceptibilidad que se estén realizando. realizado. Debe establecerse una red de comunicación que permita a los médicos notificar a los funcionarios de salud pública sobre el posible fracaso del tratamiento y enviar muestras de presuntas fallas de tratamiento o quimioprofilaxis al laboratorio de referencia para realizar pruebas de susceptibilidad. También debe existir un mecanismo que permita a los médicos y a los funcionarios de salud pública recibir los datos de susceptibilidad de manera oportuna. Además, una red de comunicación debe incluir enlaces a farmacias y farmacéuticos para monitorear los cambios en las prácticas de prescripción y el uso de antibióticos. Los cambios pueden reflejar fallas en el tratamiento y / o la quimioprofilaxis y pueden justificar una mayor investigación. Control de calidad para las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos de N. meningitidis, H. influenzae, y S. pneumoniae Para garantizar la validez y precisión de los resultados obtenidos mediante las pruebas de susceptibilidad, es vital que exista un sistema de control de calidad (CC) en el laboratorio. Los objetivos del control de calidad son verificar la repetibilidad y precisión de la prueba de susceptibilidad que se utiliza, el rendimiento de los reactivos utilizados en las pruebas y el rendimiento de los laboratorios que realizan las pruebas y leen los resultados. Por lo tanto, es vital incluir organismos de control con diámetros de zona conocidos o rangos de MIC a los antibióticos que se están probando. CLSI, CA-SFM y EUCAST han recomendado cepas que se utilizarán como controles de calidad para las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. Consulte las Tablas 1-5 para conocer las tensiones y los límites tanto para la difusión del disco como para la determinación de la CIM recomendada por CLSI, CA-SFM y EUCAST. Un laboratorio debe elegir qué cepa (s) de control de calidad utilizar en función de los antimicrobianos que se analizarán para determinar su susceptibilidad. 20 pruebas fuera de los límites de control (consulte las Tablas 1-5), luego las pruebas se pueden realizar una vez por semana. Alternativamente, si las pruebas se realizan con menos frecuencia, las pruebas de control de calidad deben realizarse con cada grupo de pruebas. También deben realizarse con cada nuevo lote de medio de prueba de susceptibilidad antimicrobiana y cada vez que se utilice un nuevo lote de discos o tiras de gradiente. Tenga en cuenta que las pautas de control de calidad y puntos de corte de CLSI se pueden encontrar en el documento: Estándares de rendimiento para el vigésimo primer suplemento informativo de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (5).
    1. Acción correctiva para resultados de control de calidad fuera de rango Adaptado de:
      1. CLSI. Estándares de rendimiento para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos en disco Aprobado estándar y mdashDécima edición. Documento CLSI M2-A10. Wayne, PA: Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio 2009, p 27-33.
      2. CLSI. Estándares de rendimiento para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos en disco Aprobado estándar y mdashDécima edición. Documento CLSI M2-A10. Wayne, PA: Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio 2009, p 27-33.

      Los resultados de CC periódicamente estarán fuera del rango normal. Si los diámetros de zona o MIC producidos por las cepas de control están fuera de los rangos esperados, el laboratorio debe considerar las siguientes posibles fuentes de error:

      • Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos se ven afectadas por las variaciones en el medio, el tamaño del inóculo o la fase de crecimiento, el tiempo de incubación, la temperatura y otros factores ambientales. El medio utilizado puede ser una fuente de error si no cumple con las pautas recomendadas por CLSI, CA-SFM o EUCAST. Por ejemplo, el agar que contiene cantidades excesivas de timidina o timina puede revertir los efectos inhibidores de las sulfonamidas y la trimetoprima, provocando que las zonas de inhibición del crecimiento sean más pequeñas o menos distintas. Los organismos pueden parecer resistentes a estos fármacos cuando en realidad no lo son. Deben seguirse estrictamente las directrices de QC / QA para la preparación de los medios.
      • Si la profundidad del agar en la placa no es uniformemente de 3-4 mm, la velocidad de difusión de los agentes antimicrobianos o la actividad de los fármacos puede verse afectada.
      • Si el pH del medio de prueba no está entre 7,2 y 7,4, la velocidad de difusión de los agentes antimicrobianos o la actividad de los fármacos pueden verse afectadas. Nota: no intente ajustar el pH del medio de prueba de agar Mueller-Hinton si está fuera del rango.

      Tabla 1. Recomendaciones de CLSI para límites aceptables para cepas de control de calidad utilizadas para monitorear la precisión de la difusión del disco Kirby-Bauer

      Material protegido por derechos de autor utilizado con permiso del Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA, EE. UU. 19087, www.clsi.org.

      Documento CLSI M100-S21 2011, págs. 114-117.

      Recomendaciones de CLSI para límites aceptables para cepas de control de calidad utilizadas para monitorear la precisión de la difusión del disco Kirby-Bauer
      Antimicrobiano
      Agente
      Disco
      Contenido
      E. coli 1
      ATCC 25922 2
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      H. influenzae 3
      ATCC 49427
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      S. pneumoniae 4
      ATCC 49619
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      Ampicilina 10 y microg 16-22 13-21 30-36
      Ceftriaxona 30 y microg 29-35 31-39 30-35
      Ciprofloxacina 5 y microg 30-40 34-42 -5
      Eritromicina 15 y microg & ndash & ndash 25-30
      Penicilina 10 unidades & ndash & ndash 24-30
      Rifampicina 5 y microg 8-10 22-30 25-30
      Trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol) 6 1,25 / 23,75 y microg 23-29 24-32 20-28

      Notas al pie

      1 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton sin sangre u otros suplementos.

      2 ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia, EE. UU. http://www.atcc.org/.

      3 Los valores son válidos para probar esta cepa de CC en Haemophilus medio de prueba incubado en CO al 5%2 durante 16-18 horas a 35 ° C.

      4 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton suplementado con sangre de oveja desfibrinada al 5% incubada en CO al 5%2 durante 16-18 horas a 35 ° C.

      6 El trimetoprim-sulfametoxazol es una combinación de dos medicamentos que se usan en el tratamiento (cotrimoxazol). La relación 1:20 es aquella en la que se ha demostrado la mayor sinergia en el tratamiento en suero. Los discos se impregnan con 1,25 µg de trimetoprima y 23,75 µg de sulfametoxazol para imitar la proporción 1:20.

      Tabla 2. Recomendaciones de CLSI para límites aceptables para cepas de QC utilizadas para monitorear la precisión de concentraciones inhibitorias mínimas (MIC)

      Material protegido por derechos de autor utilizado con permiso del Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA, EE. UU. 19087, www.clsi.org.

      Documento CLSI M100-S21 2011, págs. 122-125.

      Recomendaciones de CLSI para límites aceptables para cepas de control de calidad utilizadas para monitorear la precisión de concentraciones inhibitorias mínimas (MIC)
      Antimicrobiano
      Agente
      E. coli 1
      ATCC 25922
      (y microg / ml)
      H. influenzae 2
      ATCC 49427
      (y microg / ml)
      S. pneumoniae 3
      ATCC 49619
      (y microg / ml)
      Ampicilina 2-8 2-8 0.06-0.25
      Ceftriaxona 0.03-0.12 0.06-0.25 0.03-0.12
      Ciprofloxacina 0.004-0.015 4 0.004-0.03 -5
      Eritromicina & ndash & ndash 0.03-0.12
      Penicilina & ndash & ndash 0.25-1
      Rifampicina 4-16 0.25-1 0.015-0.06
      Tetraciclina 0.5-2 4-32 0.06-0.5
      Trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol) 6 & le0.5 / 9.5 0.03/0.59-0.25/4.75 0.12/2.4-1/19

      Notas al pie

      1 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en caldo Mueller-Hinton ajustado por cationes (CAMHB) sin sangre u otros suplementos.

      2 Los valores son válidos para probar esta cepa de CC en Haemophilus caldo medio de prueba incubado en aire ambiente durante 20-24 horas a 35 ° C.

      3 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en CAMHB con sangre de caballo lisada (2,5-5,0% v / v) incubada en 5% CO2 o aire ambiente durante 20-24 horas a 35 ° C. Tenga en cuenta que para S. pneumoniae que no es ATCC 49619, las placas deben incubarse al aire ambiente.

      4 Los límites de control de calidad son los mismos para ciprofloxacina si E. coli ATCC 25922 se prueba en CAMHB con sangre de caballo lisada (2,5-5,0% v / v).

      6 El trimetoprim-sulfametoxazol es una combinación de dos medicamentos que se usan en el tratamiento (cotrimoxazol). La mayor sinergia en suero se ha encontrado cuando los dos fármacos están en una proporción de 1:20, por lo que los puntos de corte se dan en una proporción de 1/20 de trimetoprima / sulfametoxazol, es decir, & le0.5 & microg / ml trimetoprim / 9.5 & microg / ml sulfametoxazol .

      Tabla 3. Recomendaciones de CA-SFM para los límites aceptables para las cepas de QC utilizadas para monitorear la precisión de la difusión del disco de Kirby-Bauer y para monitorear la precisión de MIC

      Los límites de CC de difusión de disco de Kirby-Bauer se dan para E. coli CIP 7624 y S. aureus Los límites de CIP 7625 y MIC QC se dan para S. pneumoniae CIP 107808. Muchos de los antibióticos enumerados en este capítulo no tienen límites de control de calidad establecidos por CA-SFM.

      Comité de L & rsquoAntibiogramme de la Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Recomendaciones 2010, p8.

      Recomendaciones de CA-SFM para límites aceptables para cepas de QC utilizadas para monitorear la precisión de la difusión del disco Kirby-Bauer y para monitorear la precisión de MIC
      Antimicrobiano
      Agente
      Disco
      Contenido
      E. coli 1
      CIP 7624 2
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      Staphylococcus aureus 1
      CIP 7625 3
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      S. pneumoniae 4
      CIP 104485
      (y microg / ml)
      Cefotaxima 30 y microg 32.5-37.5 & ndash 5 0.03-0.25
      Ciprofloxacina 5 y microg 31-38 & ndash & ndash
      Eritromicina 15 unidades & ndash 26.5-31.5 & ndash
      Penicilina G 6 y microg
      (10 unidades)
      & ndash 31-38.5 0.125-0.5
      Rifampicina 30 y microg & ndash 34.0-39.0 & ndash
      Trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol) 6 1,25 / 23,75 y microg 25.5-30.5 28.0-32.5 & ndash

      Notas al pie

      1 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton, McFarland 0.5, incubado en aire ambiente durante 20-24 ha 35-37 ° C.

      2 CIP: Collection de Bact & eacuteries de l & sharp Institut Pasteur, París, Francia http://www.crbip.pasteur.fr/. Esta cepa es equivalente a E. coli ATCC 25922.

      3 CIP: esta cepa es equivalente a S. aureus ATCC 25923.

      4 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton suplementado con sangre de oveja al 5%, McFarland 0.5, incubado en aire ambiente durante 18-24 ha 35-37 ° C. Para el cotrimoxazol, utilice un suplemento de agar Mueller-Hinton con sangre de caballo hemolizada al 5%.

      6 El trimetoprim-sulfametoxazol es una combinación de dos medicamentos que se usan en el tratamiento (cotrimoxazol). La relación 1:20 es aquella en la que se ha demostrado la mayor sinergia en el tratamiento en suero. Los discos están impregnados con 1,25 µg de trimetoprima y 23,75 µg de sulfametoxazol para imitar la proporción 1:20.

      Tabla 4. Recomendaciones de EUCAST para límites aceptables para cepas de CC utilizadas para monitorear la precisión de la difusión del disco de Kirby-Bauer

      Los datos provienen del ícono externo del sitio web del Comité Europeo de Pruebas de Sensibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST), versión 1.3, diciembre de 2010. Puede encontrar más información en este sitio web.

      Recomendaciones de EUCAST para límites aceptables para cepas de control de calidad utilizadas para monitorear la precisión de la difusión del disco de Kirby-Bauer
      Antimicrobiano
      Agente
      Disco
      Contenido
      E. coli 1
      ATCC 25922 2
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      H. influenzae 3
      ATCC 9334 4
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      S. pneumoniae 5
      ATCC 49619 6
      diámetro de la zona, mm entero más cercano
      Ampicilina 2 y microg & ndash 7 19-25 25-31
      Ampicilina 10 y microg 16-22 & ndash & ndash
      Azitromicina 15 y microg & ndash & ndash & ndash
      Bencilpenicilina 1 unidad & ndash & ndash 15-21
      Cefotaxima 5 y microg 25-31 29-35 28-34
      Ceftriaxona 30 y microg 29-35 33-41 32-38
      Cloranfenicol 30 y microg 21-27 30-38 24-30
      Ciprofloxacina 5 y microg 30-40 31-39 22-28
      Clindamicina 2 y microg & ndash & ndash 22-28
      Eritromicina 15 y microg & ndash 12-18 26-32
      Levofloxacina 5 y microg 29-37 32-38 21-27
      Meropenem 10 y microg 28-34 28-34 30-38
      Ácido nalidíxico 30 y microg 22-28 27-33 & ndash
      Rifampicina 5 y microg & ndash 20-26 26-32
      Telitromicina 15 y microg & ndash 15-21 27-33
      Tetraciclina 30 y microg 18-25 28-34 28-34
      Trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol) 8 1,25 / 23,75 y microg 23-29 26-34 20-26

      Notas al pie

      1 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton, McFarland 0.5, air, 35 & plusmn1 & ordmC, 18 & plusmn2 hours.

      2 equivalente E. coli Las cepas de QC son: NCTC 12241, CIP 7624, DSM 1103 y CCUG 17620 NCTC: Colección Nacional de Cultivos Tipo, Laboratorio Central de Salud Pública PHLS, Londres, Reino Unido https://www.hpacultures.org.uk/collections/nctc.jsp icono externo CIP: Collection de Bact & eacuteries de l & aguda Institut Pasteur, París, Francia http://www.crbip.pasteur.fr/ DSM: DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania https://www.dsmz.de / icono externo CCUG: Colección de cultivos, Universidad de G & oumlteborg, Departamento de Bacteriología Clínica, G & oumlteborg, Suecia http://www.ccug.se/ icono externo

      3 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton con un 5% de sangre de caballo y 20 & microg / ml de NAD, McFarland 0,5, 5% de CO2, 35 y másmn1 y ordmC, 18 y másmn2 horas.

      4 equivalente H. influenzae Las cepas de QC son: NCTC 8468, CIP 54.94 y CCUG 23946.

      5 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre de caballo y 20 & microg / ml de b-NAD, McFarland 0,5, 5% de CO2, 35 y másmn1 y degC, 18 y másmn2 horas.

      6 Las cepas de control de calidad de S. pneumoniae equivalentes son: NCTC 12977, CIP 104340, DSM 11967 y CCUG 33638.

      8 Trimetoprim-sulfametoxazol es una combinación de dos medicamentos que se usan en el tratamiento (cotrimoxazol). La relación 1:20 es aquella en la que se ha demostrado la mayor sinergia en el tratamiento en suero. Los discos están impregnados con 1,25 µg de trimetoprima y 23,75 µg de sulfametoxazol para imitar la proporción 1:20.

      Tabla 5. Recomendaciones de EUCAST para límites aceptables para cepas de QC utilizadas para monitorear la precisión de MIC *

      Los datos provienen del ícono externo del sitio web del Comité Europeo de Pruebas de Sensibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST), versión 1.3, diciembre de 2010. Puede encontrar más información en este sitio web.

      * EUCAST aún no ha establecido límites de control de calidad de MIC para H. influenzae ATCC 9334

      Recomendaciones de EUCAST para límites aceptables para cepas de control de calidad utilizadas para monitorear la precisión de MIC
      Antimicrobiano
      Agente
      E. coli 1
      ATCC 25922 2
      (y microg / ml)
      S. pneumoniae 3
      ATCC 49619 4
      (y microg / ml)
      Ampicilina 2-8 0.064-0.25
      Azitromicina & ndash 5 0.064-0.25
      Bencilpenicilina & ndash -0.25-1
      Cefotaxima 0.032-0.125 0.032-0.125
      Ceftriaxona 0.032-0.125 0.032-0.125
      Cloranfenicol 2-8 2-8
      Ciprofloxacina 0.004-0.016 & ndash
      Clindamicina & ndash 0.032-0.125
      Eritromicina & ndash 0.032-0.125
      Levofloxacina 0.008-0.064 0.5-2
      Meropenem 0.008-0.064 0.064-0.25
      Ácido nalidíxico 1-4 & ndash
      Rifampicina & ndash 0.016-0.064
      Telitromicina 0.004-0.032
      Tetraciclina & ndash 0.125-0.5
      Trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol) 6 & le0.5 / 9.5 7 0.125/2.4-1/19

      Notas al pie

      1 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton, McFarland 0.5, air, 35 & plusmn1 & degC, 18 & plusmn2 hours.

      2 equivalente E. coli Las cepas de QC son: NCTC 12241, CIP 76.24, DSM 1103 y CCUG 17620.

      3 Los valores son válidos para probar esta cepa de control de calidad en agar Mueller-Hinton con sangre de caballo al 5% y b-NAD 20 & microg / ml, McFarland 0,5, 5% CO2, 35 y másmn1 y degC, 18 y másmn2 horas.

      4 equivalente S. pneumoniae Las cepas de QC son: NCTC 12977, CIP 104340, DSM 11967 y CCUG 33638.

      6 El trimetoprim-sulfametoxazol es una combinación de dos medicamentos que se usan en el tratamiento (cotrimoxazol). La mayor sinergia en suero se ha encontrado cuando los dos fármacos están en una proporción de 1:20, por lo que los puntos de corte se dan en una proporción de 1/20 de trimetoprima / sulfametoxazol, es decir, & le0,12 & microg / ml de trimetoprim / 2,4 & microg / ml de sulfametoxazol .

      7 Objetivo establecido por la Norma Internacional ISO 20776-1: 2006. No hay rango disponible de EUCAST.

      • Si el inóculo no es un cultivo puro o no contiene una concentración de bacterias que se aproxime al estándar de turbidez de 0,5 McFarland, los resultados de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana se verán afectados. Por ejemplo, un organismo resistente podría parecer susceptible si se utilizan muy pocas bacterias en el inóculo. Además, incluso si los aislamientos son susceptibles, cuando se utilizan colonias de medio de agar sangre para preparar una suspensión mediante el método del inóculo directo, los antagonistas de trimetoprima o sulfonamida pueden transferirse y producir una neblina de crecimiento dentro de las zonas de inhibición que rodean a trimetoprima-sulfametoxazol. (cotrimoxazol) discos. Además, solo se deben utilizar cultivos en fase de crecimiento, es decir, cultivos desarrollados en 20-24 horas.

      Si el resultado fuera de rango se debe a una razón obvia, como el uso de un disco o una tira de gradiente incorrectos, el uso de la cepa de control incorrecta, la contaminación obvia de la cepa o el uso de temperaturas o condiciones de incubación incorrectas, documente la razón. y vuelva a probar la deformación el día en que se observe el error. Si el resultado repetido está dentro del rango, no se requieren más acciones correctivas.

      Si no hay una razón obvia para el resultado fuera de rango, se requiere una acción correctiva inmediata. Pruebe la combinación de agente / organismo antimicrobiano fuera de rango el día en que se observe el error y controle durante un total de cinco días de prueba consecutivos y documente todos los resultados. Si los resultados de las pruebas de los cinco días están dentro del rango aceptable, no es necesaria ninguna acción correctiva adicional. Sin embargo, si alguno de los cinco resultados permanece fuera de rango, se requiere una acción correctiva adicional. Mientras tanto, se deben realizar pruebas de control diarias hasta que se resuelva el problema.

      Si la acción correctiva inmediata no resuelve el problema, entonces se deben investigar otras fuentes comunes de error para verificar que:

      • Los resultados se midieron y transcribieron correctamente.
      • El estándar de turbidez no había expirado, se almacenó correctamente, cumplió con los requisitos de rendimiento y se mezcló adecuadamente antes de su uso.
      • Todos los materiales, incluidos los discos y las tiras reactivas de gradiente, se encontraban dentro de sus fechas de caducidad y se almacenaron y utilizaron a la temperatura adecuada.
      • La incubadora estaba a la temperatura y atmósfera adecuadas.
      • Otros equipos utilizados, como pipetas, estaban funcionando correctamente y midiendo con precisión.
      • La cepa de control no había cambiado y no estaba contaminada.
      • Las suspensiones de inóculo se prepararon y ajustaron correctamente.
      • El inóculo se utilizó dentro de los 15 minutos posteriores a la preparación.
      • El inóculo para la prueba se preparó a partir de una placa incubada durante el tiempo correcto y no tenía más de 24 horas.

      Si es necesario, obtenga una nueva cepa de control de calidad del almacenamiento en el congelador o de una fuente confiable. También pueden ser necesarios nuevos lotes de materiales. Puede resultar útil intercambiar cepas y materiales de control de calidad con otro laboratorio que utilice el mismo método para verificar los resultados. Hasta que se resuelva el problema, puede ser necesario utilizar un método de prueba alternativo, si hay alguno disponible.

      Figura 1. Prueba de difusión con disco de susceptibilidad a los antimicrobianos: colocación aproximada del disco y medición de los diámetros de la zona de inhibición.
      ATB1 = antibiótico 1, ATB2 = antibiótico 2, etc.

      Los aislamientos que se van a analizar deben subcultivarse en una placa de agar chocolate e incubarse en una atmósfera reforzada con CO2 (5% CO2 en un CO2incubadora o frasco de extinción de velas) a 35 ° C y másmn2 ° C durante 20-24 horas antes de la prueba. Si el organismo ha sido congelado, debe subcultivarse dos veces cuando se saca del congelador antes de proceder con las pruebas de susceptibilidad.

      Retire las placas de agar del refrigerador y deje que alcancen la temperatura ambiente (25 ° C) antes de inocular. Caliente el caldo Mueller-Hinton ajustado a cationes (CAMHB) a 35 ° C antes de usarlo. Deje que los discos de antibióticos que se utilizarán en el lote de prueba se calienten a temperatura ambiente (25 ° C).

      1. Con un aplicador con punta de algodón estéril, toque la superficie de una a cuatro colonias aisladas morfológicamente idénticas. Sumerja el aplicador en un tubo que contenga CAMHB estéril. Frote ligeramente el aplicador contra la pared del tubo para liberar una pequeña cantidad de crecimiento en el líquido. Tape el tubo y mezcle las células usando un vórtice para formar una suspensión, teniendo cuidado de no formar espuma o burbujas en la suspensión al mezclar las células. Ajuste la turbidez del inóculo a la de un estándar de turbidez de 0,5 McFarland (aproximadamente de 1 a 4 x 108 UFC / ml). La preparación de un estándar de turbidez de McFarland se describe en el anexo. Si la turbidez del inóculo es mayor que el estándar, diluirlo con CAMHB para igualar la turbidez del estándar. Esta suspensión debe usarse dentro de los 15 minutos.
        • Realice recuentos regulares de colonias para verificar que la densidad de la suspensión de inóculo sea correcta. Por ejemplo, diluir la suspensión 1: 100 y subcultivar 10 & microl en el medio recomendado. Un inóculo aceptable debe dar aproximadamente 100 a 500 colonias. No es necesario realizar recuentos de colonias en cada aislamiento analizado.
      2. Sumerja un hisopo estéril con punta de algodón en el inóculo ajustado. Elimine el exceso de líquido presionando la punta del hisopo contra el interior del tubo. Inocular la superficie completa de una placa de agar sangre tres veces con el mismo hisopo de inóculo, rotando la placa 60 grados después de cada inoculación para asegurar una distribución uniforme del inóculo y el crecimiento confluente de las bacterias. Use un solo hisopo de inóculo y no devuelva el hisopo al caldo después de cada rotación.
      3. Deje que el inóculo se seque en la superficie de la placa (lo que debería tomar aproximadamente de 5 a 10 minutos). Asegúrese de que la placa esté completamente seca antes de continuar, pero no exceda los 15 minutos.
      4. Cuando la superficie de la placa inoculada esté seca y los discos estén a temperatura ambiente, coloque los discos sobre el agar con un aplicador o pinzas estériles. Asegúrese de que los discos estén a una distancia suficiente en el agar para que las zonas de inhibición no se superpongan (Figura 1). Presione los discos hacia abajo para asegurar un contacto completo con la superficie del agar. Alternativamente, se puede utilizar un dispensador de disco mecánico. Una vez aplicado, es importante no mover los discos de antibiótico ya que el antibiótico comenzará a difundirse inmediatamente al entrar en contacto con la placa.
      5. Incube las placas en posición invertida en un 5% de CO2 atmósfera o tarro de vela durante 20-24 horas a 35 & plusmn2 & degC.
      6. Después de la incubación durante la noche, mida el diámetro de cada zona de inhibición con una regla o calibradores (Figura 2). Las mediciones deben realizarse en una cabina de bioseguridad, si es posible. Las zonas de inhibición en el medio que contiene sangre se miden desde la superficie superior de la placa con la parte superior retirada. Utilice calibradores o una regla con un mango adjunto para estas medidas, sosteniendo la regla sobre el centro de la superficie del disco al medir la zona de inhibición (Figuras 1 y 2).
        • Se debe tener cuidado de no tocar el disco o la superficie del agar. Descontamine la regla de vez en cuando para evitar la transmisión de la bacteria. En todas las mediciones, las zonas de inhibición se miden como el diámetro desde los bordes de la última colonia visible a simple vista. Registre los resultados al milímetro más cercano (mm).
      7. Interprete la susceptibilidad antimicrobiana de la cepa que se está probando (y verifique que los resultados de las cepas de CC estén dentro del rango de control aceptable) comparando los resultados con los tamaños de zona estándar de CLSI (Tabla 6) o CA-SFM (Tabla 7). Consulte la Figura 3 para ver una hoja de trabajo de muestra para registrar los resultados de la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos para N. meningitidis.

      Figura 2. Imágenes que muestran la medición adecuada del diámetro de la zona. En el caso de un aislado completamente resistente al antimicrobiano, simplemente mida el diámetro del disco: 6 mm (izquierda). Cuando haya una zona de inhibición, mida el diámetro como se muestra: 16 mm (derecha).

      Fecha de prueba:
      Prueba realizada por:
      Interpretación de susceptibilidad: S= susceptible I= intermedio R= resistente

      Tabla 6: # de muestra, aislado, organismo y antibióticos
      Muestra
      número
      Meningitis
      ¿Aislar?
      Organismo Antibiótico n. ° 1 Antibiótico # 2 Antibiótico # 3 Antibiótico # 4
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      mm
      y microg / ml
      SEÑOR
      Cepa de control de calidad N / A Cepa de control de calidad mm
      y microg / ml
      sí No
      mm
      y microg / ml
      sí No
      mm
      y microg / ml
      sí No
      mm
      y microg / ml
      sí No

      Figura 3. Hoja de muestra para registrar datos e información de control de calidad. Nota: Después de 20-24 horas de incubación, verifique los resultados de las cepas de control de calidad con los rangos estándar aceptables si están dentro de los límites de control, continúe leyendo los resultados del aislado de prueba. Registre los resultados de difusión del disco en mm y los resultados de MIC en & microg / ml. Los rangos de la zona de inhibición y los puntos de corte para la interpretación de los resultados se pueden encontrar en las Tablas 1-5, según las cepas de CC utilizadas y las pautas que se sigan.

      Tabla 6. Estándares interpretativos del diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para N. meningitidis según lo recomendado por CLSI

      Material protegido por derechos de autor utilizado con permiso del Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA, EE. UU. 19087, https://www.clsi.org icono externo.

      Documento CLSI M100-S21 2011, pp 108-110.

      Estándares interpretativos del diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para N. meningitidis según lo recomendado por CLSI
      Antimicrobiano
      Agente / Clase
      Disco
      Contenido
      Diámetro de zona,
      mm entero más cercano
      MIC Interpretativo
      Estándar (y microg / ml)
      S I R S I R
      Penicilinas
      Penicilina 1 & ndash 2 & ndash & ndash & le 0.06 0.12-0.25 & ge 0.5
      CEFEMAS
      Ceftriaxona 3 30 y microg & ge 34 & ndash & ndash & le 0.12 & ndash & ndash
      MACRÓLIDOS
      Azitromicina 3,4,5 15 y microg & ge 20 & ndash & ndash & le 2 & ndash & ndash
      FLUOROQUINOLONAS
      Ciprofloxacina 4 5 y microg & ge 35 33-34 & le 32 & le 0.03 0.06 & ge 0.12
      FENICOLOS
      Cloranfenicol 6 30 y microg & ge 26 20-25 & le 19 & le 2 4 & ge 8
      ANSAMICINAS
      Rifampicina 3 5 y microg & ge 25 20-24 & le 19 & le 0.5 1 & ge 2

      Notas al pie

      1 Pruebas de difusión en disco con penicilina para N. meningitidis son poco fiables. Deben utilizarse pruebas de CMI para este organismo.

      3 Para algunos agentes antimicrobianos, la ausencia o la aparición rara de cepas resistentes impide definir categorías de resultados que no sean & ldquosusceptible & rdquo.

      4 Puede ser apropiado solo para la profilaxis de contactos de casos meningocócicos. Estos puntos de corte no se aplican a la terapia de pacientes con enfermedad meningocócica invasiva. Recientemente, se ha sugerido que la detección de susceptibilidad reducida a ciprofloxacina usando un disco de ácido nalidíxico de 30 ug es útil para detectar cepas meningocócicas resistentes a quinolonas asociadas con gyrA mutaciones (7).

      5 Los criterios de interpretación se desarrollaron inicialmente utilizando las CIM determinadas por incubación en aire ambiente para los cálculos farmacodinámicos.

      6 No se informa de forma rutinaria sobre aislamientos del tracto urinario.

      Tabla 7. Estándares interpretativos del diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para N. meningitidis según lo recomendado por CA-SFM

      Comité de L & rsquoAntibiogramme de la Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Recomendaciones 2010, p 44.

      Estándares interpretativos del diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para N. meningitidis según lo recomendado por CA-SFM
      Antimicrobiano
      Agente / Clase
      Disco
      Contenido
      Diámetro de zona,
      mm entero más cercano
      MIC interpretativo
      Estándar (y microg / ml)
      S R S R
      Penicilinas
      Penicilina G 1
      Amoxicilina 1
      Oxacilina 1
      & ndash 2
      & ndash
      5 y microg
      & ndash
      & ndash
      & ge 18
      & ndash
      & ndash
      & ndash
      & le 0.06
      & le 0.12
      & ndash
      & gt 0,25
      & gt 1
      & ndash
      CEFEMAS
      Cefotaxima 2
      Ceftriaxona 2
      30 y microg
      30 y microg
      & ndash
      & ndash
      & ndash
      & ndash
      & le 0.12
      & le 0.12
      & ndash
      & ndash
      FENICOLOS
      Cloranfenicol 30 y microg & ge 30 & ndash & le 2 & gt 4
      ANSAMICINAS
      Rifampicina 3 30 y microg & ge 30 & ndash & le 0,25 & ndash
      FLUOROQUINOLONAS
      Ciprofloxacina & ndash & ndash & ndash & le 0.03 & gt 0,06

      Notas al pie

      1 Ensayos de difusión en disco con amoxicilina y penicilina G para N. meningitidis son poco fiables. La prueba se puede realizar usando discos de oxacilina de 5 & microg / ml. Los diámetros de & ge 18 mm son sensibles a la penicilina G, pero las CMI frente a penicilina G y / o amoxicilina deben determinarse para aquellos diámetros de & lt 18 mm.

      3 Usado solo para profilaxis.

      Cuadro 8. Estándares interpretativos de MIC para N. meningitidis según lo recomendado por EUCAST

      EUCAST aún no tiene pautas interpretativas para la difusión en disco de Kirby-Bauer para N. meningitidis.

      Estándares interpretativos de MIC para N. meningitidis según lo recomendado por EUCAST
      Antimicrobiano
      Agente / Clase
      MIC (y microg / ml)
      Estándar interpretativo
      S R
      Penicilinas
      Bencilpenicilina
      Ampicilina
      & le 0.064
      & le 0.125
      & gt 0,25
      & gt 1.0
      CEFEMAS
      Cefotaxima 1
      Ceftriaxona 1
      & le 0.125
      & le 0.125
      & gt 0,125
      & gt 0,125
      CARBAPENÉMICOS
      Meropenem 1,2 & le 0,25 & gt 0,25
      ANSAMICINAS
      Rifampicina & le 0,25 & gt 0,25
      TETRACICLINAS
      Tetraciclina 3 & le 1.0 & gt 2.0
      FLUOROQUINOLONAS
      Ciprofloxacina 4 & le 0.032 & gt 0,064
      FENICOLOS
      Cloranfenicol & le 2.0 & gt 4.0

      Notas al pie

      1 Las cepas con valores de CMI superiores al punto de corte de susceptibilidad son muy raras o aún no se han informado. Las pruebas de identificación y susceptibilidad a los antimicrobianos en cualquiera de estos aislamientos deben repetirse y, si se confirma el resultado, el aislado debe enviarse a un laboratorio de referencia. Hasta que no exista evidencia con respecto a la respuesta clínica para los aislados confirmados con CMI por encima del punto de corte de resistencia actual, deben notificarse como resistentes.

      2 Estos puntos de corte se refieren únicamente a la meningitis.

      3 La tetraciclina se puede utilizar para determinar la susceptibilidad a la minociclina para la profilaxis de N. meningitidis infecciones.

      4 Los puntos de corte se aplican solo para su uso en la profilaxis de la enfermedad meningocócica.

      1. Con un aplicador con punta de algodón estéril, toque la superficie de una a cuatro colonias aisladas morfológicamente idénticas. Sumerja el aplicador en un tubo que contenga CAMHB estéril. Frote ligeramente el aplicador contra la pared del tubo para liberar una pequeña cantidad de crecimiento en el líquido. Tape el tubo y mezcle las células usando un vórtice para formar una suspensión, teniendo cuidado de no formar espuma o burbujas en la suspensión al mezclar las células. Ajuste la turbidez del inóculo a la de un estándar de turbidez de 0,5 McFarland (aproximadamente 1 a 4 x10 8 UFC / ml). La preparación de un patrón de turbidez de McFarland se describe en el anexo. Si la turbidez del inóculo es mayor que el estándar, diluirlo con CAMHB para igualar la turbidez del estándar. Esta suspensión debe usarse dentro de los 15 minutos.
        • Realice recuentos regulares de colonias para verificar que la densidad de la suspensión de inóculo sea correcta. Por ejemplo, diluir la suspensión 1: 100 y subcultivar 10 & microl en el medio recomendado. Un inóculo aceptable debe dar aproximadamente de 100 a 500 colonias. No es necesario realizar recuentos de colonias en cada aislamiento analizado.
      2. Sumerja un hisopo estéril con punta de algodón en el inóculo ajustado. Elimine el exceso de líquido presionando la punta del hisopo contra el interior del tubo. Inocular la superficie completa de un agar Mueller-Hinton de 15 y 150 mm con una placa de sangre de oveja al 5% tres veces con el mismo hisopo de inóculo, rotando la placa 60 grados después de cada inoculación para asegurar una distribución uniforme del inóculo y el crecimiento confluente de las bacterias. Utilice un solo hisopo de inóculo y no devuelva el hisopo al caldo después de cada rotación.

      Figura 4. Colocación de tiras de gradiente en una placa de agar de 100 mm. Las tiras de degradado se colocan en orientación opuesta. & ldquoT & rdquo representa la parte superior de la franja de degradado.

      Figura 5. Colocación de tiras de gradiente en una placa de agar de 150 mm. El área de menor concentración de antibiótico debe orientarse hacia el centro de la placa. & ldquoT & rdquo representa la parte superior de la franja de degradado.

      • Devuelva las tiras de gradiente antimicrobiano que no se utilizarán en este lote de pruebas al congelador a -20 ° C (algunas tiras se pueden almacenar a 4 ° C. Siga las instrucciones del fabricante y rsquos).

      Leer e interpretar las tiras de degradado

      Lea el MIC en el punto donde la zona de inhibición se cruza con la escala MIC en la tira. Utilice luz oblicua para examinar cuidadosamente el punto final. Se puede usar una lupa si es necesario. Leer en el punto de inhibición completa de todo el crecimiento, incluidas las nebulosas. Vea el ícono externo de inserción de producto más reciente [10 páginas] ícono externo, o acceda al ícono externo de la guía de la aplicación.

      Primero registre los resultados del control de calidad. Si las zonas producidas por la cepa de CC están fuera de los rangos esperados (consulte las Tablas 2, 3 y 5, según las cepas y las pautas que se utilicen), el laboratorista debe considerar las posibles fuentes de error. Debido a que los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos pueden verse afectados por muchos factores no necesariamente asociados con la susceptibilidad real del organismo (p. Ej., Tamaño del inóculo, fase de crecimiento, profundidad del agar, almacenamiento, tiempo y otros), las prácticas de control de calidad deben seguirse cuidadosamente (consulte la Sección II arriba). Si todos los agentes antimicrobianos están en el rango de control, lea las CIM de la prueba. Tenga en cuenta cualquier observación inusual, como una zona de muerte incompleta (puntos finales finales) o colonias individuales que crecen dentro de la elipse.

      Las marcas de gradación en la tira de gradiente corresponden a las concentraciones de dilución estándar al doble para el método de dilución en agar, pero también incluyen incrementos entre esos valores estándar. Los valores estándar se utilizan para interpretar y notificar los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos.Se recomienda que tanto la lectura real del valor de la tira como el siguiente valor estándar más alto (es decir, el valor que se utilizará para la interpretación) se incluyan en los registros de laboratorio para la prueba de la cepa. Por ejemplo, si se prueba la susceptibilidad de un aislado a la penicilina, una CIM registrada a partir de las gradaciones en la tira de gradiente podría ser de 0,094 & microg / ml, sin embargo, la CIM informada sería de 0,125 & microg / ml.

      El fabricante de las tiras de gradiente recomienda seguir los puntos de corte de MIC desarrollados para microdilución en agar y caldo. Se proporcionan los estándares interpretativos y los puntos de corte de MIC recomendados por CLSI (Tabla 6), CA-SFM (Tabla 7) y EUCAST (Tabla 8).

      1. Pruebas H. influenzae para la producción de betalactamasa Una prueba rápida de betalactamasa puede proporcionar información clínicamente relevante antes que los resultados de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, por lo que debe realizarse tan pronto como H. influenzae es identificado.
        1. Las pruebas a base de nitrocefina son el método preferido. El reactivo está compuesto por discos de papel impregnados con cefalosporina cromogénica, que libera un compuesto rojo por hidrólisis por una β-lactamasa. Realización de la prueba: Los discos se pueden almacenar en su cartucho a 2-8 ° C hasta la fecha de vencimiento. Después de abrir el cartucho, los discos se pueden almacenar durante 2 meses a 2-8 ° C.
          1. Deje que el tubo que contiene el cartucho alcance la temperatura ambiente (25 ° C).
          2. Humedezca un disco con agua destilada estéril.
          3. Recolecte algunas colonias aisladas de las cepas que se van a analizar y extiéndalas sobre la superficie del disco.

          Lectura e interpretación

          La aparición de un color rojo revela una reacción positiva.
          La reacción es negativa si no ha aparecido color después de 30 minutos.

          Staphylococcus aureus Resultado ATCC 29213 +
          Enterococcus faecalis ATCC 29212 resultado y ndash

          Medios y discos para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos

          Para H. influenzae, la susceptibilidad a los antimicrobianos se puede determinar mediante el método de difusión en disco. El método presentado en este capítulo es una modificación de la técnica de Kirby-Bauer que ha sido estandarizada por CLSI. Si se realiza con precisión de acuerdo con el siguiente protocolo, este método proporcionará datos que pueden predecir de forma fiable la eficacia in vivo del fármaco en cuestión. La precisión y reproducibilidad de esta prueba depende del uso constante de un conjunto estándar de procedimientos en el laboratorio.

          El medio óptimo es el medio de prueba de Haemophilus (HTM). El agar Mueller-Hinton utilizado para fabricar HTM debe estar libre de timidina para obtener resultados consistentes si se va a probar la susceptibilidad al cotrimoxazol. El medio HTM consta de los siguientes ingredientes: agar Mueller-Hinton suplementado con 15 & microg / ml de NAD, 15 & microg / ml de hemina bovina y 5 mg / ml de extracto de levadura. El pH se ajusta de 7,2 a 7,4. Los agentes recomendados probados son ampicilina, ceftriaxona y / o cefotaxima, y ​​cloranfenicol, que son antibióticos comúnmente usados ​​para el tratamiento de la meningitis.

          El disco de 10 μg-ampicilina predice la resistencia intrínseca (mediada por PBP) y mediada por beta-lactamasa a penicilina y ampicilina de H. influenzae. Se utiliza un disco de 30 μg-cloranfenicol para predecir la resistencia al cloranfenicol y un disco de 30 μg-ceftriaxona y / o cefotaxima para predecir la susceptibilidad a estos antibióticos. Los tamaños de los diámetros de las zonas solo se pueden interpretar correctamente cuando se utiliza HTM. Los resultados deben compararse con los estándares que han sido validados, como los recomendados por CLSI (Tabla 9), CA-SFM (Tabla 10) y EUCAST (Tabla 11).

          Las pruebas de control de calidad deben realizarse una vez por semana si las pruebas de susceptibilidad se realizan a diario o con cada grupo de pruebas cuando las pruebas se realizan con menos frecuencia que todos los días. Deben realizarse pruebas de control de calidad para cada nuevo lote de medio de prueba o nuevo lote de discos. Si los resultados encontrados para la cepa de control son precisos, se supone que el procedimiento es correcto. Si este no es el caso, las pruebas pueden verse afectadas por la variación en el medio, el tamaño del inóculo, el tiempo de incubación, la temperatura, la profundidad del agar en la placa (uniformemente 3-4 mm), el pH (entre 7,2-7,4), la potencia del disco, la pureza del cultivo para el inóculo o si la concentración de bacterias no se aproxima al estándar de turbidez de 0,5 de McFarland. CLSI, CA-SFM y EUCAST enumeran las cepas de control de calidad y los límites de prueba recomendados (Tablas 1, 3 y 4). Un laboratorio debe elegir qué cepa (s) de control de calidad utilizar en función de los antimicrobianos que se analizarán para determinar la susceptibilidad.

          Tabla 9. Estándares interpretativos del diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para H. influenzae según lo recomendado por CLSI

          Material protegido por derechos de autor utilizado con permiso del Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA, EE. UU. 19087, www.clsi.org.

          Documento CLSI M100-S21 2011, págs. 88-91.

          Estándares interpretativos del diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para H. influenzae según lo recomendado por CLSI
          Antimicrobiano
          Agente / Clase
          Disco
          Contenido
          Diámetro de zona,
          Entero más cercano mm
          MIC interpretativo
          Estándar (y microg / ml)
          S I R S I R
          Penicilinas
          Ampicilina 1 10 y microg & ge 22 19-21 & le 18 & le 1 2 & ge 4
          CEFEMAS
          Cefotaxima 2
          Ceftriaxona 2
          30 y microg
          30 y microg
          & ge 26
          & ge 26
          & ndash
          & ndash
          & ndash
          & ndash
          & le 2
          & le 2
          & ndash
          & ndash
          & ndash
          & ndash
          FENICOLOS
          Cloranfenicol 30 y microg & ge 29 26-28 & le 25 & le 2 4 & ge 8

          Notas al pie

          1 En la mayoría de los casos, una prueba de b-lactamasa directa puede proporcionar un medio rápido para detectar la resistencia a la ampicilina y amoxicilina. La mayoría de los aislamientos de H. influenzae que son resistentes a ampicilina y amoxicilina producen un tipo TEM y beta-lactamasa.

          2 Para algunos agentes antimicrobianos, la ausencia o la aparición rara de cepas resistentes impide definir categorías de resultados distintas de & ldquosusceptible & rdquo.

          Tabla 10.Diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para H. influenzae según lo recomendado por CA-SFM

          Comité de L & rsquoAntibiogramme de la Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Recomendaciones 2010, pp 42-43.

          Diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares de interpretación de MIC para H. influenzae según lo recomendado por CA-SFM
          Antimicrobiano
          Agente / Clase
          Disco
          Contenido
          Diámetro de zona,
          Entero más cercano mm
          MIC (y microg / ml)
          Estándar interpretativo
          S R S R
          Penicilinas
          Ampicilina 1,2 2 y microg & ge 20 & lt 20 & le 1 & gt1
          CEFEMAS
          Ceftriaxona o cefotaxima 3 & ndash & ndash & ndash & le 0.12 & ndash
          FENICOLOS
          Cloranfenicol 30 y microg & ge 30 & lt 26 & le 1 & gt 2

          Notas al pie

          1 Una prueba cromogénica directa y beta-lactamasa positiva predice la resistencia a la penicilina, ampicilina y amoxicilina.

          Las cepas 2 & beta-lactamasa negativas, resistentes a ampicilina (BLNAR) son raras, pero la detección de una menor susceptibilidad a beta-lactámicos en cepas BLNAR es posible usando un disco de ampicilina de 2 & microg (diámetro & lt 20 mm) o un disco de cefalotina de 30 & microg ( diámetro & lt 17 mm).

          3 No se ha informado falla clínica ni resistencia para estos agentes antimicrobianos, por lo que no se han establecido los criterios para los puntos de corte interpretativos para ninguna categoría que no sea susceptible.

          Tabla 11.Diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares de interpretación de MIC para H. influenzae según lo recomendado por EUCAST.

          Diámetro de la zona de difusión en disco de Kirby-Bauer y estándares de interpretación de MIC para H. influenzae según lo recomendado por EUCAST
          Antimicrobiano
          Agente / Clase
          Disco
          Contenido
          Diámetro de zona,
          Entero más cercano mm
          MIC (y microg / mL)
          Estándar interpretativo
          S R S R
          Penicilinas
          Ampicilina 1,2 2 y microg & ge 16 & lt 16 & le 1 & gt1
          CEFEMAS
          Cefotaxima 3
          Ceftriaxona 3
          5 y microg
          30 y microg
          & ge 22
          & ge 27
          & lt 22
          & lt 27
          & le 0.125
          & le 0.125
          & ndash
          & ndash
          FENICOLOS
          Cloranfenicol 30 y microg & ge 30 & lt 26 & le 1 & gt 2

          Notas al pie

          1 Informe de cepas positivas para betalactamasas resistentes a penicilinas sin inhibidores de betalactamasas.

          2 Los puntos de corte se refieren únicamente a las cepas negativas a betalactamasa. Las cepas pueden ser resistentes a penicilinas, aminopenicilinas, cefalosporinas y / o carbapenémicos debido a cambios en las proteínas de unión a penicilina (BLNAR y betalactamasa negativa resistente a ampicilina) y algunas cepas tienen ambos mecanismos de resistencia (BLPACR y betalactamasa positiva, amoxicilina / clavulanato). resistente).

          3 No se han notificado fallos clínicos ni resistencias para estos agentes antimicrobianos, por lo que no se han establecido los criterios para los puntos de corte interpretativos para ninguna categoría que no sea susceptible.

          Procedimiento de prueba de susceptibilidad antimicrobiana de H. influenzae por Kirby-Bauer disk diffusion

          Se pueden utilizar placas de 150 mm o 100 mm para la difusión en disco de Kirby-Bauer, según la cantidad de agentes antimicrobianos que se probarán por aislamiento. Las pautas de CLSI establecen que no se pueden usar más de dos discos en una placa de 100 mm y que se pueden usar hasta cinco discos en una placa de 150 mm (Figura 1).

          Los aislamientos que se van a analizar deben subcultivarse en una placa de agar chocolate suplementado e incubarse en un CO2-atmósfera mejorada (5% CO2 en un CO2incubadora o frasco de extinción de velas) a 35 ° C y másmn2 ° C durante 20-24 horas antes de la prueba. Si el organismo ha sido congelado, debe subcultivarse dos veces cuando se saca del congelador antes de proceder con las pruebas de susceptibilidad.

          Retire las placas de agar del refrigerador y deje que alcancen la temperatura ambiente (25 ° C) antes de inocular. Si se va a usar caldo HTM para preparar 0.5 McFarland, caliéntelo a 35 ° C antes de usarlo. Deje que los discos de antibióticos que se utilizarán en el lote de prueba se calienten a temperatura ambiente (25 ° C).

          1. Retire las placas de agar del refrigerador y deje que alcancen la temperatura ambiente (25 ° C) antes de inocular. Si se va a usar caldo HTM para preparar 0.5 McFarland, caliéntelo a 35 ° C antes de usarlo. Deje que los discos de antibióticos que se utilizarán en el lote de prueba se calienten a temperatura ambiente (25 ° C).
            • Realice recuentos regulares de colonias para verificar que la densidad de la suspensión de inóculo sea correcta. Por ejemplo, diluir la suspensión 1: 100 y subcultivar 10 & microl en el medio recomendado. Un inóculo aceptable debe dar aproximadamente de 100 a 500 colonias. No es necesario realizar recuentos de colonias en cada aislamiento analizado.
          2. Sumerja un hisopo estéril con punta de algodón en el inóculo ajustado. Elimine el exceso de líquido presionando la punta del hisopo contra el interior del tubo. Inocular la superficie completa de una placa HTM tres veces con el mismo hisopo de inóculo, girando la placa 60 grados después de cada inoculación para asegurar una distribución uniforme del inóculo y el crecimiento confluente de las bacterias. Utilice un solo hisopo de inóculo y no devuelva el hisopo al caldo después de cada rotación.
          3. Deje que el inóculo se seque en la superficie de la placa (lo que debería tomar aproximadamente de 5 a 10 minutos). Asegúrese de que la placa esté completamente seca antes de continuar, pero no exceda los 15 minutos.
          4. Cuando la superficie de la placa inoculada esté seca y los discos estén a temperatura ambiente, coloque los discos sobre el agar con un aplicador o pinzas estériles. Asegúrese de que los discos estén a una distancia suficiente en el agar para que las zonas de inhibición no se superpongan (Figura 1). Presione los discos hacia abajo para asegurar un contacto completo con la superficie del agar. Alternativamente, se puede utilizar un dispensador de disco mecánico. Una vez aplicado, es importante no mover los discos de antibiótico ya que el antibiótico comenzará a difundirse inmediatamente al entrar en contacto con la placa.
          5. Incube las placas en posición invertida en un 5% de CO2 atmósfera o tarro de vela durante 20 & ndash24 horas a 35 & plusmn2 & degC.
          6. Después de la incubación durante la noche, mida el diámetro de cada zona de inhibición con una regla o calibradores (Figura 2). Las mediciones deben realizarse en una cabina de bioseguridad, si es posible. Las zonas de inhibición en el medio se miden sosteniendo la placa de Petri unos centímetros por encima de un fondo negro no reflectante iluminado con luz reflejada. Utilice calibradores o una regla con un mango adjunto para estas medidas, sosteniendo la regla sobre el centro de la superficie del disco al medir la zona de inhibición (Figuras 1 y 2).
            • Se debe tener cuidado de no tocar el disco o la superficie del agar. Descontamine la regla de vez en cuando para evitar la transmisión de la bacteria. En todas las mediciones, las zonas de inhibición se miden como el diámetro desde los bordes de la última colonia visible a simple vista. Registre los resultados al milímetro más cercano (mm).
          7. Interprete la susceptibilidad antimicrobiana de la cepa que se está probando (y verifique que los resultados de las cepas de QC estén dentro del rango de control aceptable) comparando los resultados con el CLSI (Tabla 9), CA-SFM (Tabla 10) o EUCAST (Tabla 11). ) tamaños de zona estándar. Consulte la Figura 3 para ver una hoja de trabajo de muestra para registrar los resultados de la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos para H. influenzae.
          1. Con un aplicador con punta de algodón estéril, toque la superficie de una a cuatro colonias aisladas morfológicamente idénticas. Sumerja el aplicador en un tubo que contenga caldo HTM estéril o solución salina. Frote ligeramente el aplicador contra la pared del tubo para liberar una pequeña cantidad de crecimiento en el líquido. Tape el tubo y mezcle las células usando un vórtice para formar una suspensión, teniendo cuidado de no formar espuma o burbujas en la suspensión al mezclar las células. Ajuste la turbidez del inóculo a la de un estándar de turbidez de 0,5 McFarland (aproximadamente de 1 a 4 x 108 UFC / ml). La preparación de un patrón de turbidez de McFarland se describe en el anexo. Si la turbidez del inóculo es mayor que el estándar, dilúyalo con caldo HTM o solución salina para igualar la turbidez del estándar. Esta suspensión debe usarse dentro de los 15 minutos.
            • Realice recuentos regulares de colonias para verificar que la densidad de la suspensión de inóculo sea correcta. Por ejemplo, diluir la suspensión 1: 100 y subcultivar 10 & microl en el medio recomendado. Un inóculo aceptable debe dar aproximadamente de 100 a 500 colonias. No es necesario realizar recuentos de colonias en cada aislamiento analizado.
          2. Sumerja un hisopo estéril con punta de algodón en el inóculo ajustado. Elimine el exceso de líquido presionando la punta del hisopo contra el interior del tubo. Inocular la superficie completa de una placa HTM tres veces con el mismo hisopo de inóculo, rotando la placa 60 grados después de cada inoculación para asegurar una distribución uniforme del inóculo y el crecimiento confluente de las bacterias. Utilice un solo hisopo de inóculo y no devuelva el hisopo al caldo después de cada rotación.
          3. Deje que el inóculo se seque en la superficie de la placa (lo que debería tomar aproximadamente de 5 a 10 minutos). Asegúrese de que la placa esté completamente seca antes de continuar, pero no exceda los 15 minutos.
          4. Cuando la superficie de la placa inoculada esté seca y las tiras de gradiente estén a temperatura ambiente, coloque las tiras de gradiente antimicrobiano en el agar con un aplicador o pinzas estériles. Asegúrese de que los valores de MIC impresos estén hacia arriba (es decir, que la superficie inferior de la tira que contiene el gradiente antimicrobiano esté en contacto con el agar). Alternativamente, algunos fabricantes ofrecen aplicadores robóticos de tiras de gradiente. Una vez aplicadas, es importante no mover las tiras de gradiente antimicrobiano ya que el antibiótico se difunde en el agar inmediatamente al entrar en contacto.
            • Devuelva las tiras de gradiente antimicrobiano que no se utilizarán en este lote de pruebas al congelador a -20 ° C (algunas tiras se pueden almacenar a 4 ° C. Siga las instrucciones del fabricante y rsquos).
          5. Incube las placas en posición invertida en un 5% de CO2 atmósfera o tarro de vela durante 20 & ndash24 horas a 35 & plusmn2 & degC.
          6. Después de la incubación, se habrá formado una elipse de crecimiento bacteriano en la placa alrededor de la tira y se podrá leer la prueba (ver más abajo). Los resultados de CC deben revisarse antes de leer e interpretar el MIC.

          Leer e interpretar las tiras de degradado

          Lea el MIC en el punto donde la zona de inhibición se cruza con la escala MIC en la tira. Utilice luz oblicua para examinar cuidadosamente el punto final. Se puede usar una lupa si es necesario. Leer en el punto de inhibición completa de todo el crecimiento, incluidas las nebulosas. Un ícono de PDF de inserción de producto completo [2 páginas] ícono externo, incluye una guía de lectura para las tiras de degradado, o acceda a la guía de lectura solo ícono de pdf [2 páginas] ícono externo.

          Primero registre los resultados del control de calidad. Si las zonas producidas por la cepa de control están fuera de los rangos esperados (ver Tablas 2, 3 y 5, dependiendo de las cepas y pautas que se utilicen), el laboratorista debe considerar posibles fuentes de error. Debido a que los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos pueden verse afectados por muchos factores no necesariamente asociados con la susceptibilidad real del organismo (p. Ej., Tamaño del inóculo, fase de crecimiento, profundidad del agar, almacenamiento, tiempo y otros), las prácticas de control de calidad deben seguirse cuidadosamente (consulte la Sección II arriba). Si todos los agentes antimicrobianos están en el rango de control, lea las CIM de la prueba. Tenga en cuenta cualquier observación inusual, como una zona de muerte incompleta (puntos finales finales) o colonias individuales que crecen dentro de la elipse.

          Las marcas de gradación en la tira de gradiente corresponden a las concentraciones de dilución estándar al doble para el método de dilución en agar, pero también incluyen incrementos entre esos valores estándar. Los valores estándar se utilizan para interpretar y notificar los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. Se recomienda que tanto la lectura real del valor de la tira como el siguiente valor estándar más alto (es decir, el valor que se utilizará para la interpretación) se incluyan en los registros de laboratorio para la prueba de la cepa. Por ejemplo, si se prueba la susceptibilidad de un aislado a la penicilina, una CIM registrada a partir de las gradaciones en la tira de gradiente podría ser de 0,094 & microg / ml, sin embargo, la CIM informada sería de 0,125 & microg / ml.

          El fabricante de las tiras de gradiente recomienda seguir los puntos de corte de MIC desarrollados para microdilución en agar y caldo. Se proporcionan los estándares interpretativos y los puntos de corte de MIC recomendados por CLSI (Tabla 9), CA-SFM (Tabla 10) y EUCAST (Tabla 11).

          Las pruebas de control de calidad deben realizarse como parte de la rutina normal de laboratorio. Para verificar que los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos sean precisos, se debe incluir al menos un organismo de control con cada prueba o nuevo conjunto de condiciones de prueba. CLSI, CA-SFM y EUCAST enumeran las cepas de control de calidad y los límites de prueba recomendados (Tabla 1 y ndash5). Un laboratorio debe elegir qué cepa (s) de control de calidad utilizar en función de los antimicrobianos que se analizarán para determinar la susceptibilidad. Se puede encontrar más información sobre la resolución de problemas con resultados de control de calidad fuera de rango en la Sección II anterior.

          1. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana de S. pneumoniae por difusión en disco de Kirby-Bauer Se recomienda el medio de agar Mueller-Hinton suplementado con sangre de carnero al 5% para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de S. pneumoniae especímenes por difusión en disco. Las placas de agar deben tener una profundidad uniforme de 3-4 mm. Prepare el inóculo para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de S. pneumoniae de cultivos frescos y puros de S. pneumoniae (cultivado durante la noche en sangre o agar chocolate). Prepare suspensiones celulares de las bacterias que se analizarán en salina fisiológica estéril o en caldo Mueller-Hinton. Para el inóculo se utiliza una suspensión de células igual a una densidad de un estándar de turbidez de 0,5 McFarland (aproximadamente de 1 a 4 x 108 UFC / ml). La preparación de un estándar de turbidez de McFarland se describe en el Anexo.
            1. Suspenda las colonias viables de una placa de agar chocolate o sangre de oveja durante la noche en un tubo de caldo o solución salina para lograr una suspensión bacteriana equivalente a un estándar de turbidez de 0,5 McFarland; tenga cuidado de no formar espuma o burbujas en la suspensión al mezclar las células con el caldo.
            2. Compare la densidad de la suspensión con el estándar de turbidez de 0.5 McFarland sosteniendo la suspensión y el estándar de turbidez de McFarland frente a una luz contra un fondo blanco con líneas negras contrastantes. Si la densidad es demasiado alta, la suspensión debe diluirse con solución salina o caldo (lo que se haya usado para hacer la suspensión). Si la densidad no es suficiente, se deben agregar bacterias adicionales a la suspensión. Esta suspensión debe usarse dentro de los 15 minutos.
              • Realice recuentos regulares de colonias para verificar que la densidad de la suspensión de inóculo sea correcta. Por ejemplo, diluir la suspensión 1: 100 y subcultivar 10 & microl en el medio recomendado. Un inóculo aceptable debe dar aproximadamente de 100 a 500 colonias. No es necesario realizar recuentos de colonias en cada aislamiento analizado.
            3. Cuando se logre la densidad adecuada, sumerja un hisopo de algodón en la suspensión bacteriana. Levántelo del caldo y elimine el exceso de líquido presionando y girando el hisopo contra la pared del tubo.
            4. Utilice el hisopo para inocular la superficie completa de la placa de agar Mueller-Hinton suplementada tres veces, rotando la placa 60 grados entre cada inoculación. Utilice el mismo hisopo con cada racha rotada, pero no vuelva a sumergir el hisopo en el inóculo (es decir, la suspensión de células bacterianas).
            5. Deje que el inóculo se seque antes de colocar los discos en las placas. El secado generalmente toma solo unos minutos y no debería tomar más de 15 minutos. Si el secado tarda más de 15 minutos, use un volumen menor de inóculo en el futuro presionando más líquido fuera del hisopo.
            6. Una vez que la placa esté seca, coloque los discos antimicrobianos en las placas (Figura 1). Utilice unas pinzas estériles para colocar los discos en el agar Mueller-Hinton y golpéelos suavemente para asegurarse de que se adhieran al agar. Alternativamente, se puede utilizar un dispensador de disco mecánico. La difusión del fármaco en el disco comienza inmediatamente, por lo tanto, una vez que un disco entra en contacto con la superficie del agar, el disco no debe moverse.
            7. Incube las placas en posición invertida en un 5% de CO2 atmósfera durante 20-24 horas a 37 ° C. Se puede usar un frasco de extinción de velas si un CO2-incubadora no está disponible.
              • Si se trata de un nuevo lote de agar Mueller-Hinton, los discos antimicrobianos son nuevos o es un momento adecuado para realizar el control de calidad, siga los pasos 1 a 7 anteriores y ejecute pruebas paralelas en las cepas de referencia. Los tamaños de zona de difusión de disco apropiados para las cepas de control de calidad de referencia se incluyen en las Tablas 1, 3 y 4.
            8. Después de la incubación durante la noche, mida el diámetro de cada zona de inhibición con una regla o calibradores. Las zonas de inhibición se miden desde la superficie superior de la placa con la parte superior retirada. Utilice calibradores o una regla con un mango adjunto para estas medidas, sosteniendo la regla sobre el centro de la superficie del disco al medir la zona de inhibición (Figura 1).
              • Se debe tener cuidado de no tocar el disco o la superficie del agar. Descontamine la regla de vez en cuando para evitar la transmisión de la bacteria. En todas las mediciones, las zonas de inhibición se miden como el diámetro desde los bordes de la última colonia visible. Registre los resultados en milímetros (mm). La Figura 3 proporciona un formulario de muestra para registrar los resultados.
            9. Interprete la susceptibilidad antimicrobiana de la cepa que se está probando (y verifique que los resultados de las cepas de control de calidad estén dentro del rango de control aceptable) comparando los resultados con el CLSI (Tabla 12), CA-SFM (Tabla 13) o EUCAST. (Tabla 14) tamaños de zona estándar.

            Notas al pie

            1 Rx: El uso de penicilina en la meningitis requiere terapia con dosis máximas de penicilina intravenosa (por ejemplo, al menos 3 millones de unidades cada cuatro horas en adultos con función renal normal).

            2 La penicilina, cefotaxima y ceftriaxona deben analizarse mediante un método de CMI confiable y deben informarse de manera rutinaria con cepas de CSF S. pneumoniae.

            3 Para los aislamientos de LCR, informe solo las interpretaciones de meningitis.

            4 Los aislamientos de neumococos con zonas de oxacilina de> 20 mm son susceptibles (CMI <0,06 mg / ml) a la penicilina. Se deben determinar las CIM de penicilina y cefotaxima, ceftriaxona o meropenem para aquellos aislados con diámetros de zona de oxacilina de & le 19 mm, porque las zonas de & le 19 mm ocurren con cepas resistentes a penicilina, intermedias o ciertas cepas susceptibles. Para aislamientos con zonas de oxacilina & le 19 mm, no informe la penicilina como resistente sin realizar una prueba de CIM de penicilina.

            5 Rx: El uso de cefotaxima o ceftriaxona en la meningitis requiere terapia con dosis máximas.

            6 Los puntos de corte para los aislamientos de casos de meningitis son idénticos a los de la ceftriaxona.

            7 La susceptibilidad y resistencia a azitromicina, claritromicina y diritromicina pueden predecirse usando eritromicina.

            8 El agar Mueller-Hinton utilizado para esta prueba debe estar libre de timidina para obtener resultados precisos.

            9 El trimetoprim-sulfametoxazol es una combinación de dos fármacos que se utilizan en el tratamiento (cotrimoxazol). La relación 1:20 es aquella en la que se ha demostrado la mayor sinergia en el tratamiento en suero. Los discos están impregnados con 1,25 µg de trimetoprima y 23,75 µg de sulfametoxazol. Los puntos de corte de MIC imitan la relación 1/20.

            10 Los organismos sensibles a la tetraciclina también se consideran susceptibles a la doxiciclina y la minociclina.

            Tabla 13.Diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para S. pneumoniae según lo recomendado por CA-SFM

            Comité de L & rsquoAntibiogramme de la Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Soci & eacutet & eacute Fran & ccedilaise de Microbiologie, Recomendaciones 2010, pp 38-39.

            Diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares de interpretación de MIC para S. pneumoniae según lo recomendado por CA-SFM
            Antimicrobiano
            Agente / Clase
            Disco
            Contenido
            Diámetro de zona,
            Entero más cercano mm
            MIC interpretativo
            Estándar (y microg / ml)
            S R S R
            Penicilinas
            Penicilina G 1,2,3 5 & ​​microg de oxacilina & ndash & ndash & le 0.06 & gt 2
            CEFEMAS
            Cefotaxima 1,2,3
            Ceftriaxona 1,2,3
            & ndash
            & ndash
            & ndash
            & ndash
            & le 0.5
            & le 0.5
            & gt 2
            & gt 2
            MACRÓLIDOS
            Eritromicina 4 15 UI & ge 26 & lt 24 & le 0,25 & gt 0,5
            INHIBIDORES DE VÍA FOLATE 5,6,7
            Trimetoprim-sulfametoxazol 1,25 / 23,75 y microg & ge 16 & lt 10 & le 2/38 & gt8 / 152
            TETRACICLINAS
            Tetraciclina 8 30 UI & ge 23 & lt 21 & le 1 & gt 2
            FLUOROQUINOLONAS
            Levofloxacina 9 5 y microg & ge 17 & lt 17 & le 2 & gt 2
            Lincosamidas
            Clindamicina 15 y microg & ge 21 & lt 17 & le 0.5 & gt 0,5
            CETÓLIDOS
            Telitromicina 10 15 y microg & ge 24 & lt 21 & le 0,25 & gt 0,5

            Notas al pie

            1 Pruebas de difusión en disco con penicilina G para S. pneumoniae son poco fiables, pero las pruebas se pueden realizar utilizando discos de oxacilina (OXA-5) de 5 & microg / ml de acuerdo con los siguientes criterios: Los diámetros de & ge 26 mm utilizando discos OXA-5 son sensibles a la penicilina G y otros betalactámicos. Los diámetros de & lt 26 mm utilizando discos OXA-5 tienen una susceptibilidad reducida.

            2 Esta prueba no puede evaluar el nivel de resistencia a la penicilina G u otros y betalactámicos. El uso de discos de otros antibióticos y beta-lactámicos no puede determinar el nivel de resistencia a estos y beta-lactámicos.

            3 En casos de infección grave, fracaso clínico o cualquier cepa con susceptibilidad reducida, es necesario determinar la CMI a penicilina G y al menos uno de β-lactámicos con propiedades farmacodinámicas compatibles con la eficacia terapéutica (amoxicilina, cefotaxima o ceftriaxona). Las cepas categorizadas como intermedias (CMI de & gt 0.064 & microg / ml a & gt2 & microg / ml) o incluso con un nivel bajo de resistencia deben considerarse resistentes en el caso de meningitis, pero sensibles a dosis altas en el caso de infecciones respiratorias.

            4 Interpretación válida para azitromicina, claritromicina, diritromicina y roxitromicina.

            5 La prueba de trimetoprima-sulfametoxazol predice la susceptibilidad y resistencia a trimetoprima-sulfametoxazol y sulfonamidas.

            6 El agar Mueller-Hinton utilizado para esta prueba debe estar libre de timidina para obtener resultados precisos.

            7 El trimetoprim-sulfametoxazol es una combinación de dos medicamentos que se usan en el tratamiento (cotrimoxazol). La relación 1:20 es aquella en la que se ha demostrado la mayor sinergia en el tratamiento en suero. Los discos están impregnados con 1,25 µg de trimetoprima y 23,75 µg de sulfametoxazol para imitar la proporción 1:20. Los puntos de corte de MIC imitan la relación 1/20, es decir, & le2 & microg / ml trimetoprim / 38 & microg / ml sulfametoxazol.

            8 Interpretaciones válidas para otras tetraciclinas.

            9 El cribado de neumococos con susceptibilidad reducida a las fluoroquinolonas se realiza midiendo la sensibilidad a la norfloxacina. Si el diámetro alrededor del disco de norfloxacina (5 ug) es menor de 10 mm y / o si la CMI es & gt 16 & microg / ml, existe un alto riesgo de selección in vivo de mutantes resistentes a fluoroquinolonas y falla clínica.

            10 La resistencia a la telitromicina debe verificarse volviendo a realizar la prueba en ausencia de CO2.

            Tabla 14.Diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares interpretativos de MIC para S. pneumoniae según lo recomendado por EUCAST

            Los datos provienen del sitio web del Comité Europeo de Pruebas de Sensibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST), http://www.eucast.org icono externo, versión 1.3, diciembre de 2010.

            Diámetro de la zona de difusión del disco de Kirby-Bauer y estándares de interpretación de MIC para S. pneumoniae según lo recomendado por EUCAST
            Antimicrobiano
            Agente / Clase
            Disco
            Contenido
            Diámetro de zona,
            Entero más cercano mm
            MIC interpretativo
            Estándar (y microg / ml)
            S R S R
            PENICILINAS 1
            Oxacilina (pantalla) 1,2 1 y microg & ge 20 & lt 20 & ndash & ndash
            Bencilpenicilina 1,2,3 & ndash & ndash & le 0.064 & gt 2
            CEFEMAS
            Cefotaxima 4,5
            Ceftriaxona 4,5
            & ndash
            & ndash
            & ndash
            & ndash
            & le 0.5
            & le 0.5
            & gt 2
            & gt 2
            MACRÓLIDOS
            Eritromicina 6 15 y microg & ge 22 & lt 19 & le 0,25 & gt 0,5
            INHIBIDORES DE VÍA FOLATE
            Trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol) 7 1,25 / 23,75 y microg & ge 18 & lt 15 & le 1 & gt2
            TETRACICLINAS
            Tetraciclina 8 30 y microg & ge 23 & lt 20 & le 1 & gt 2
            FLUOROQUINOLONAS9
            Levofloxacina 9,10 5 y microg & ge 19 & lt 19 & le 2 & gt 2
            Lincosamidas
            Clindamicina 11 2 y microg & ge 19 & lt 19 & le 0.5 & gt 0,5
            CETÓLIDOS
            Telitromicina 10 15 y microg & ge 25 & lt 22 & le 0,25 & gt 0,5

            Notas al pie

            1 La mayoría de los valores de CMI para penicilina, ampicilina, amoxicilina y piperacilina (con o sin un inhibidor de la betalactamasa) difieren en no más de un paso de dilución y los aislamientos son totalmente susceptibles a la bencilpenicilina (CMI & le0.064 y ampmicrog / ml susceptibles mediante la detección del disco de oxacilina , ver nota 2) se puede informar que es susceptible a los agentes betalactámicos a los que se les han asignado puntos de corte.

            2 Detecte la resistencia a los betalactámicos con el disco de oxacilina 1 y microg. Los aislamientos categorizados como susceptibles pueden ser reportados como susceptibles a bencilpenicilina, fenoximetilpenicilina y aminopenicilinas (con o sin inhibidor de β-lactamasa) independientemente de la indicación clínica. Los aislamientos categorizados como resistentes a la oxacilina pueden reportarse resistentes a la bencilpenicilina y la fenoximetilpenicilina en la meningitis. Para otros y betalactámicos, determine la CMI del agente considerado para uso clínico.

            3 En la meningitis, solo los aislamientos con MIC & le0.064 & microg / ml (susceptibles mediante la detección del disco de oxacilina, ver nota 2) deben clasificarse como susceptibles a la bencilpenicilina; de lo contrario, notifique que son resistentes. Para indicaciones distintas de la meningitis y la neumonía, utilice puntos de corte de 0,064 y 2 & microg / ml.

            4 Las cepas con valores de CMI por encima del punto de corte de susceptibilidad son muy raras o aún no se han informado. Las pruebas de identificación y susceptibilidad antimicrobiana de cualquiera de estos aislamientos deben repetirse y, si se confirma el resultado, el aislado debe enviarse a un laboratorio de referencia. Hasta que no exista evidencia con respecto a la respuesta clínica de los aislados confirmados con CMI por encima del punto de corte de resistencia actual, deben notificarse como resistentes.

            5 Detecte la resistencia a los betalactámicos con el disco de oxacilina 1 y microg. Los aislados categorizados como susceptibles pueden ser reportados como susceptibles a cefepima, cefotaxima, cefpodoxima, ceftriaxona y cefuroxima, y ​​cefuroxima axetilo. Los aislamientos categorizados como resistentes a la oxacilina deben analizarse con un método de CMI con el agente considerado para uso clínico.

            6 Se puede usar eritromicina para determinar la susceptibilidad a azitromicina, claritromicina y roxitromicina.

            7 Trimetoprim-sulfametoxazol en proporción 1:19. Los puntos de corte se expresan como la concentración de trimetoprima.

            8 Los aislamientos sensibles a la tetraciclina también lo son a la doxiciclina y la minociclina. Algunos aislados resistentes a tetraciclina pueden ser susceptibles a minociclina y / o doxiciclina.

            9 La prueba de difusión en disco de norfloxacina se puede utilizar para detectar la resistencia a las fluoroquinolonas. Los aislamientos categorizados como susceptibles pueden reportarse susceptibles a levofloxacina y moxifloxacina e intermedios a ciprofloxacina y ofloxacina. Los aislamientos categorizados como resistentes deben analizarse para determinar su susceptibilidad a agentes individuales.

            10 Los puntos de corte para levofloxacino se relacionan con la terapia de dosis alta.

            11 La resistencia inducible a la clindamicina solo se puede detectar en presencia de un antibiótico macrólido. En las pruebas de difusión por disco, busque un aparente antagonismo de la clindamicina por la eritromicina (prueba D).

            La estandarización y el control de calidad deben realizarse en cada laboratorio de acuerdo con las pautas estandarizadas que se presentan en este manual.

            Los métodos para la conservación y almacenamiento de aislamientos y los métodos detallados para el transporte de aislamientos de acuerdo con las regulaciones internacionales se presentan en el Capítulo 14: Almacenamiento y envío de N. meningitidis, S. pneumoniae, y H. influenzae.

            Con el aumento de las pruebas de resistencia a los antimicrobianos que se realizan fuera de los laboratorios de referencia internacionales, las tiras de prueba de gradiente de antimicrobianos sirven como un método de evaluación que es conveniente y confiable. Requieren menos experiencia técnica que las pruebas de MIC mediante métodos de dilución, pero dan resultados comparables. Guarde las tiras reactivas de gradiente antimicrobiano según lo recomendado por el fabricante, generalmente a 4 ° C o en un congelador a -20 ° C.

            Aunque este manual sirve como una guía general para el uso de tiras de gradiente antimicrobiano, siempre siga las instrucciones del fabricante y rsquos, ya que ciertas combinaciones de antibiótico-bacteria (& ldquodrug-bug & rdquo) tienen requisitos de prueba especiales.

            Por lo tanto, este manual de laboratorio sugiere que se debe usar agar Mueller-Hinton con 5% de sangre de carnero al realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de S. pneumoniae con las tiras reactivas antimicrobianas (excepto cuando se prueba la sensibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol (cotrimoxazol), en cuyo caso se debe utilizar sangre de caballo en lugar de sangre de oveja). Se pueden utilizar placas de 100 mm o 150 mm, según el número de tiras reactivas antimicrobianas utilizadas por muestra (Figuras 4 y 5). Se pueden colocar dos tiras reactivas antimicrobianas diferentes en direcciones de gradiente opuestas en una placa de 100 mm. Este manual de laboratorio sugiere que para evitar zonas superpuestas de inhibición del crecimiento, no se utilicen más de cinco tiras reactivas antimicrobianas en una placa de 150 mm. Dependiendo de las combinaciones de bacterias / antimicrobianos, cinco tiras en una placa de 150 mm pueden dar lugar a elipses superpuestos. Si esto ocurre, vuelva a realizar la prueba con cuatro tiras por placa.

            Los aislamientos que se van a analizar deben subcultivarse en una placa de agar sangre e incubarse en un recipiente de CO2-atmósfera mejorada (5% CO2 en un CO2incubadora o frasco de extinción de velas) a 35 ° C y másmn2 ° C durante 20-24 horas antes de la prueba. Si el organismo ha sido congelado, debe subcultivarse dos veces cuando se saca del congelador antes de proceder con las pruebas de susceptibilidad.

            Caliente el caldo Mueller-Hinton ajustado a cationes (CAMHB) a 35 ° C antes de usarlo. Deje que las tiras de gradiente que se utilizarán en el lote de prueba se calienten a temperatura ambiente (25 ° C). Se recomienda seguir las instrucciones del prospecto incluido con las tiras de degradado.

            1. Con un aplicador con punta de algodón estéril, toque la superficie de una a cuatro colonias aisladas morfológicamente idénticas. Sumerja el aplicador en un tubo que contenga CAMHB estéril. Frote ligeramente el aplicador contra la pared del tubo para liberar una pequeña cantidad de crecimiento en el líquido. Tape el tubo y mezcle las células usando un vórtice para formar una suspensión, teniendo cuidado de no formar espuma o burbujas en la suspensión al mezclar las células. Ajuste la turbidez del inóculo a la de un estándar de turbidez de 0,5 McFarland (aproximadamente de 1 a 4 x 108 UFC / ml). La preparación de un patrón de turbidez de McFarland se describe en el anexo. Si la turbidez del inóculo es mayor que el estándar, diluirlo con CAMHB para igualar la turbidez del estándar. Esta suspensión debe usarse dentro de los 15 minutos.
              • Realice recuentos regulares de colonias para verificar que la densidad de la suspensión de inóculo sea correcta. Por ejemplo, diluir la suspensión 1: 100 y subcultivar 10 & microl en el medio recomendado. Un inóculo aceptable debe dar aproximadamente de 100 a 500 colonias. No es necesario realizar recuentos de colonias en cada aislamiento analizado.
            2. Deje que la placa se seque por hasta 15 minutos. Asegúrese de que la placa esté completamente seca antes de continuar. Mientras se seca la placa, retire las tiras reactivas antimicrobianas del almacenamiento en frío (4 ° C o -20 ° C, según las recomendaciones del fabricante y rsquos) y deje que las tiras que se utilizarán en el lote de prueba se calienten a temperatura ambiente (25 ° C). Devuelva las tiras que no se utilizarán en este lote de pruebas al almacenamiento en frío.
            3. Coloque las tiras reactivas antimicrobianas en la placa de agar seca e inoculada con un aplicador o pinzas estériles (Figuras 4 y 5).Asegúrese de que los valores MIC impresos estén hacia arriba (es decir,., que la superficie inferior de la tira que contiene el gradiente antimicrobiano está en contacto con el agar). Alternativamente, algunos fabricantes ofrecen aplicadores robóticos de tiras de gradiente. Una vez aplicado, no mueva las tiras de gradiente antimicrobiano ya que el fármaco se difunde en el agar inmediatamente al entrar en contacto.
            4. Incube las placas en posición invertida en un CO2- atmósfera enriquecida (2-5% CO2) durante 20 & ndash24 horas a 37 & degC. Se puede usar un frasco de extinción de velas si un CO2 incubadora no está disponible.
              • Siga siempre las instrucciones del fabricante y rsquos incluidas con cada paquete de tiras, porque las condiciones de incubación pueden variar según la combinación organismo-antimicrobiano (o & ldquodrug-bug & rdquo).
            5. Después de la incubación, se formará una elipse de crecimiento bacteriano en la placa alrededor de la tira y se podrá leer la tira reactiva. Es importante revisar los resultados del control de calidad antes de leer e interpretar las tiras reactivas antimicrobianas MIC.

            Leer e interpretar las tiras de degradado

            Lea el MIC en el punto donde la zona de inhibición se cruza con la escala MIC en la tira. Utilice luz oblicua para examinar cuidadosamente el punto final. Se puede usar una lupa si es necesario. Leer en el punto de inhibición completa de todo el crecimiento, incluidas las nebulosas. En: http://www.abbiodisk.com/pdf/pi/75002206 se puede encontrar una guía de lectura para las tiras de gradiente, que muestra los efectos relacionados con el organismo, los efectos relacionados con los fármacos, los efectos relacionados con el mecanismo de resistencia y los efectos técnicos y de manipulación: http://www.abbiodisk.com/pdf/pi/75002206 .pdf icono de pdf [1,68 MB, 2 páginas] icono externo.

            Primero registre los resultados del control de calidad. Si las zonas producidas por la cepa de control están fuera de los rangos esperados (ver Tablas 2, 3 y 5, dependiendo de las cepas y pautas que se utilicen), el laboratorista debe considerar posibles fuentes de error. Debido a que los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos pueden verse afectados por muchos factores no necesariamente asociados con la susceptibilidad real del organismo (p. Ej., Tamaño del inóculo, fase de crecimiento, profundidad del agar, almacenamiento, tiempo y otros), las prácticas de control de calidad deben seguirse cuidadosamente (consulte la Sección II arriba). Si todos los agentes antimicrobianos están en el rango de control, lea las CIM de la prueba. Tenga en cuenta cualquier observación inusual, como una zona de muerte incompleta (puntos finales finales) o colonias individuales que crecen dentro de la elipse.

            Las marcas de gradación en la tira de gradiente corresponden a las concentraciones de dilución estándar al doble para el método de dilución en agar, pero también incluyen incrementos entre esos valores estándar. Los valores estándar se utilizan para interpretar y notificar los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. Se recomienda que tanto la lectura real del valor de la tira como el siguiente valor estándar más alto (es decir, el valor que se utilizará para la interpretación) se incluyan en los registros de laboratorio para la prueba de la cepa. Por ejemplo, si se prueba la susceptibilidad de un aislado a la penicilina, una CIM registrada a partir de las gradaciones en la tira de gradiente podría ser de 0,094 & microg / ml, sin embargo, la CIM informada sería de 0,125 & microg / ml.

            El fabricante de las tiras de gradiente recomienda seguir los puntos de corte de MIC desarrollados para microdilución en agar y caldo. Puntos de corte interpretativos para S. pneumoniae Se muestran las combinaciones de antimicrobianos de CLSI (Tabla 12), CA-SFM (Tabla 13) y EUCAST (Tabla 14).


            ¿Están las pruebas de sangre Aβ listas para el horario de máxima audiencia?

            En el corto espacio de dos años, la antigua fantasía de un análisis de sangre para la enfermedad de Alzheimer se ha hecho realidad. O eso parece. En la Conferencia Internacional de la Asociación de Alzheimer de 2017 en Londres, Randall Bateman, De la Universidad de Washington, St. Louis, había cautivado a la audiencia al mostrar cómo un ensayo de espectroscopia de masas de plasma exquisitamente sensible detectó una pequeña caída en la proporción Aβ42 / 40 que se correlacionó con exploraciones PET positivas para amiloide cerebral (noticias de la conferencia de julio de 2017). Los científicos querían ver esto reproducido en otras cohortes. En la AAIC de este año, celebrada del 14 al 18 de julio en Los Ángeles, abundaron las presentaciones sobre las medidas de Aβ en plasma. Desde el verano pasado, hasta 11 pruebas diferentes, tanto de espectrometría de masas como de inmunoensayos, han correlacionado el Aβ42 / 40 en plasma con el Aβ y el amiloide en el LCR en el cerebro. ¿Está el plasma Aβ listo para el horario de máxima audiencia? En AAIC, algunos investigadores dijeron que sí, pero otros moderaron su entusiasmo. El desacuerdo entre la especificación de masas y los inmunoensayos surgió como un punto de fricción.

            • El plasma Aβ parece tan bueno como el LCR o la PET para el diagnóstico.
            • Los análisis de sangre reducen el tiempo y el costo de la detección de amiloidosis.
            • Pero no todos los ensayos coinciden.

            Paul Aisen, University of Southern California, San Diego, estuvo en el primer campamento. "Los análisis de plasma son geniales", dijo a Alzforum. "Cuando salieron, pensé: 'Todo es diferente ahora, pero tenemos que confirmarlo'. Bueno, se ha confirmado". Aisen está listo para usar ensayos de plasma en ensayos clínicos, aunque ve espacio para el crecimiento. “Estos ensayos no están en su estado final y cada mejora marcará la diferencia”, dijo.

            Bateman también es entusiasta. "Estoy convencido de que esto funcionará", dijo a Alzforum. “De hecho, está funcionando. Podemos tomar muestras de diferentes centros y analizarlas en nuestro ensayo de espectrometría de masas y encontrar un acuerdo total ”, dijo, y señaló que el ensayo es tan sólido que los datos de diferentes fuentes se pueden combinar para su análisis. Bateman cofundó C2N Diagnostics, St. Louis, que desarrolla ensayos de plasma, incluso para Aβ.

            Otros fueron más cautelosos, citando una falta de correlación entre los inmunoensayos y entre ellos y las pruebas de espectrometría de masas. Esto podría reflejar problemas metodológicos o diferentes formas o grupos de Aβ en plasma, señaló. Henrik Zetterberg, Universidad de Gotemburgo, Suecia. Si esos grupos reaccionan de manera diferente con diferentes anticuerpos, eso podría implicar algo importante sobre la biología subyacente, sugirieron algunos investigadores. Oskar Hansson, De la Universidad de Lund, Suecia, también adopta este punto de vista. “Necesitamos grandes, es decir, muchos cientos de casos, estudios directos que comparen diferentes ensayos de Aβ en plasma en la misma población con el mismo estándar de verdad”, dijo a Alzforum.

            Scattershot? Algunos ejemplos de un round robin que compara 11 inmunoensayos y espectrometría de masas diferentes. Encontró correlaciones generalmente débiles para las mediciones de Aβ42. Este péptido parece ser particularmente voluble, ya que las mismas pruebas arrojaron correlaciones ligeramente mejores para medir el plasma Aβ40. Las líneas rojas discontinuas representan correlaciones perfectas. [Cortesía de Henrik Zetterberg y Kaj Blennow, Universidad de Gotemburgo].

            Ensayos en abundancia
            Desde 2017 Akinori Nakamura y Colin Masters y sus colegas publicaron un método de especificación de masas para medir la relación Aβ40 / 42 que está siendo desarrollado por Shimadzu Corp. El equipo de UGothenburg optimizó su propio ensayo de especificación de masas de IP, y la empresa española Araclon ha estado trabajando en dicha prueba de especificación de masas servicio desde hace algunos años. También existen varios inmunoensayos, algunos actualmente en la empresa, algunos disponibles comercialmente (ver tabla a continuación). Todos se están probando en varias cohortes.

            En la AAIC, Bateman informó que su grupo ha probado el plasma de 158 personas más, miembros de la cuarta en una línea de cohortes que se siguen en el Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Knight en WashU. Como fue el caso en un conjunto de muestras anterior de 164 personas, la proporción plasmática Aβ42 / 40 una vez más se correlacionó estrechamente con la proporción CSF Aβ42 / 40 y con el amiloide cerebral evaluado por PET. En total, la prueba de plasma WashU predijo la amiloidosis con una especificidad y una sensibilidad del 76 y el 88 por ciento, respectivamente, dijo Bateman. En el análisis estadístico de la curva del operador del receptor, esto equivalía a un área bajo la curva de 0,88. El AUC mejoró a 0,94 cuando los investigadores tuvieron en cuenta la edad y el estado de ApoE4, lo que hace que esta prueba de Aβ en plasma sea tan buena como el LCR o la PET para diagnosticar la amiloidosis. Dirigido por Suzanne Schindler en el laboratorio de Bateman, este trabajo salió el 1 de agosto en Neurology (Schindler et al., 2019).

            Esta prueba de espectro de masas tenía poder predictivo. De ocho personas cuyas exploraciones de PET con amiloide fueron negativas al inicio del estudio pero positivas en el seguimiento, siete tenían pruebas de plasma de referencia que ya eran positivas, por debajo del valor de corte de 0,1218 para la relación Aβ42 / 40. En otras palabras, en esta pequeña muestra, las personas que resultaron negativas para amiloide por PET pero positivas para amiloide por espectrometría de masas plasmáticas tenían 15 veces más probabilidades de dar positivo en la PET más tarde que las personas que eran negativas para plasma al inicio del estudio.

            ¿Qué pasa con otras cohortes? En Los Ángeles, Bateman informó los resultados de las pruebas de muestras del estudio Australian Imaging and Biomarkers Lifestyle, el estudio sueco BioFINDER y la Iniciativa de neuroimagen de la enfermedad de Alzheimer. La prueba de plasma predijo el estado de la PET con AUC de 0,87, 0,83 y 0,85 para AIBL, BioFINDER y ADNI, respectivamente. Una vez más, la adición de ApoE4 a la ecuación elevó estas AUC a 0,93, 0,90 y 0,87. Los límites de Aβ42 / 40 para la positividad de amiloide resultaron ser 0,1235, 0,1234 y 0,1269 para AIBL, BioFINDER y ADNI, respectivamente, que está cerca de la relación de 0,1218 calculada para la cohorte WashU. Combinadas, para un total de 468 sujetos, estas tres cohortes de replicación arrojaron un punto de corte de 0,1234.

            Por su parte, los inmunoensayos están dando resultados similares. En AAIC, Hansson revisó el análisis de sus grupos del inmunoensayo en plasma Elecsys de Roche Diagnostic. Estos datos aparecieron el 24 de junio en JAMA Neurology (noticias de junio de 2019), y Alzforum los cubrió en profundidad. Brevemente, este ensayo predijo la positividad de amiloide entre 842 personas en BioFINDER con aproximadamente un 80 por ciento de precisión, un poco menos que la prueba WashU. En una cohorte de validación de 237 voluntarios en un estudio prospectivo en Alemania, el inmunoensayo Elecsys funcionó mejor, arrojando un AUC de 0,86. En la cohorte sueca, la adición de ApoE aumentó el AUC a 0,87 en la cohorte alemana, el genotipado no estaba disponible. En Los Ángeles, Hansson también informó que entre 335 personas cognitivamente normales, el ensayo de plasma Elecsys predijo quién sufriría demencia en los próximos seis años.

            Comparación cabeza a cabeza: un poco peludo
            ¿Cómo se comparan los diferentes ensayos de plasma? Dos presentaciones de la AAIC abordaron esta cuestión. Hansson mostró datos preliminares comparativos para cuatro de tales pruebas: el inmunoensayo Elecsys de Roche, el ensayo de especificación de masas ELISA Shimadzu de EUROIMMUN, y la matriz de molécula única basada en anticuerpos de Quanterix (Simoa). Todos menos el ensayo Quanterix predijeron de manera similar el estado de la PET amiloide entre 199 personas cognitivamente normales. Los AUC de Elecsys, EUROIMMUN y Shimadzu fueron 0,81, 0,76 y 0,82, respectivamente, el ensayo Simoa registró un 0,59. La adición del genotipo APOE mejoró estos valores a 0,86, 0,84, 0,87 y 0,79.

            Sin embargo, cuando toma un conjunto dado de muestras, ¿los diferentes ensayos miden la misma cantidad absoluta de Aβ en él? Aquí se pone complicado. Zetterberg presentó una comparación de 11 ensayos diferentes de Aβ42 / 40 en plasma realizados en 11 sitios diferentes (ver tabla a continuación). Codirigido por Kaj Blennow, también en UGothenburg, este estudio round robin fue un proyecto del Consorcio de Estandarización de Biomarcadores Globales. La idea era seleccionar muestras de plasma en una amplia gama de concentraciones de Aβ y enviar alícuotas de 0,25 mililitros a cada laboratorio participante, que probó estas alícuotas idénticas en sus respectivas plataformas. A diferencia del trabajo resumido en esta historia hasta ahora, este estudio no evaluó la precisión diagnóstica de ninguna prueba dada contra la PET amiloide. Más bien, determinó cómo las diferentes pruebas se correlacionaron entre sí cuando a todas se les presentó la misma cantidad de un analito dado (Aβ40 y Aβ42) en muestras idénticas.

            Quien participó. Un round robin comparó 11 ensayos diferentes para Aβ en plasma que se llevaron a cabo en 11 sitios diferentes. [Imagen cortesía de Henrik Zetterberg y Kaj Blennow, Universidad de Gotemburgo].

            Entonces, ¿cómo coincidieron las pruebas? En resumen, no bien, al menos para Aβ42. Al presentar diapositiva tras diapositiva de correlaciones por pares, Zetterberg mostró resultados que se dispersaron ampliamente en lugar de apiñarse ordenadamente alrededor de una línea. Por ejemplo, los valores de Elecsys para Aβ42 coincidieron mal con los datos de MS de UGothenburg, Shimadzu y WashU, y este último logró la correlación más alta de solo 0.22 (ver imagen a continuación). Las correlaciones de 0,27 y 0,46 entre los ensayos Elecsys y Simoa utilizados por UPenn y UAmsterdam, respectivamente, fueron ligeramente mejores, pero aún débiles. Las mejores correlaciones, de alrededor de 0,6, surgieron entre los ensayos de espectrometría de masas de UGothenburg, Araclon y Shimadzu. Calcular la relación Aβ42 / 40 no ayudó, dijo Zetterberg a Alzforum.

            Surgieron correlaciones más estrechas, en el rango de 0,6 a 0,7, para la medición de Aβ40, que es menos pegajoso y ocurre a una concentración 10 veces mayor en plasma que Aβ42. Aún así, Aβ42 es el impulsor clave de la patología amiloide y el indicador de amiloidosis.

            Cabeza a cabeza. En esta descripción general de las correlaciones del estudio de operación por turnos de Aβ en plasma, el verde indica correlaciones estrechas entre dos pruebas dadas, rojo, correlaciones débiles. [Cortesía de Henrik Zetterberg y Kaj Blennow, Universidad de Gotemburgo].

            En general, en este round robin, los métodos de espectrometría de masas mostraron menos variación entre sí que los inmunoensayos, dijo Zetterberg. Esto provocó un debate sobre si los inmunoensayos o la espectrometría de masas serán mejores. Con el primero, diferentes anticuerpos podrían detectar diferentes grupos de Aβ. Estos últimos son más difíciles de escalar y dependen de al menos un anticuerpo para la inmunoprecipitación antes de la espectrometría de masas. A continuación, se realizan comparaciones directas más amplias con diferentes grupos clínicos. "Antes de que se hayan realizado tales estudios, no me atrevería a decir que todos los métodos de EM son superiores a todos los inmunoensayos", dijo Hansson.

            Jonathan Schott, University College London, también encontró desacuerdo entre la EM y los inmunoensayos. Trabajando con Zetterberg y Blennow, el equipo de Schott comparó el Quanterix Simoa con los análisis de espectrometría de masas realizados en UGothenburg. El plasma provino de la cohorte británica de nacimiento de 1946, que es única en el sentido de que sus participantes, extraídos de todo el Reino Unido, nacieron todos en la misma semana de marzo de ese año. Se han seguido clínicamente desde su nacimiento y, en los últimos años, se agregaron biomarcadores de líquidos y PET.

            Para cada voluntario, se extrajo sangre a la misma hora del día, en las mismas condiciones de ayuno, y se trató y se congeló de la misma manera, dijo Schott. Luego, los científicos midieron Aβ40 y Aβ42 en plasma de 414 voluntarios cognitivamente normales en la cohorte.

            Para Aβ40, Simoa y los datos de espectrometría de masas coincidieron bastante bien, al igual que en el round robin. Para el conjunto de muestras completo, Quanterix arrojó una mediana de 288 pg / ml y una especificación de masa de 284 pg / ml, y al comparar muestra por muestra, los dos ensayos se correlacionaron con un coeficiente de 0,44.

            Para Aβ42, la historia fue diferente. La espectrometría de masas midió valores más altos, dando una mediana de 28,4 pg / ml frente a 19,5 pg / ml para Quanterix, y la correlación muestra por muestra tuvo un coeficiente magro de 0,22. Independientemente de si un participante tuvo una exploración por PET amiloide positiva o negativa, la EM midió más Aβ42 en la sangre que la prueba de Quanterix.

            Estas diferencias son importantes. Schott descubrió que el ensayo de espectro de masas Aβ42 / 40 predijo la positividad de la PET mejor que el ensayo Quanterix Simoa, con un AUC (sin corregir para la edad o el estado de ApoE) de 0,82 sobre 0,61.

            ¿Por qué los métodos no concuerdan? Zetterberg cree que no son solo los ensayos en sí mismos, porque estos mismos ensayos mostraron correlaciones estrechas cuando se usaron para medir Aβ42 en el LCR. Los científicos de AAIC dijeron que el problema probablemente sea el plasma. Por un lado, el plasma presenta efectos de matriz difíciles, lo que significa que la mezcla compleja de diferentes solutos en la solución puede producir resultados falsos. Diluir el plasma para obtener una matriz más similar al LCR podría ayudar, pero entonces las concentraciones de Aβ serán extremadamente bajas, lo que requerirá ensayos aún más sensibles, dijo Zetterberg. También podría ser que algunos ensayos sean particularmente sensibles a los detalles de la manipulación de muestras, que varían de un centro a otro. Los inmunoensayos pueden medir diferentes grupos de Aβ y, de 10 a 40 picogramos por mililitro, la concentración de Aβ42 en plasma siempre se mueve peligrosamente cerca del límite de detección.

            Sangriento complicado. El plasma Aβ proviene de las plaquetas, el cerebro y los órganos periféricos. Las condiciones sistémicas influyen en la concentración plasmática de Aβ. [Cortesía de Yan-Jiang Wang, Nature 2017.]

            ¿Importa qué tan bien se correlacionan los análisis siempre que diagnostiquen la amiloidosis? Los científicos parecían divididos en este punto. Blennow ve problemas en el futuro. “Cuando diferentes laboratorios usan diferentes ensayos en alícuotas idénticas que contienen una cantidad determinada de Aβ42, y miden cantidades bastante diferentes, eso es un problema”, dijo (consulte Blennow Q & ampA). Colin Masters, Universidad de Melbourne, Australia, se hizo eco del sentimiento, al igual que Ralph Martins de la Universidad Edith Cowan, Perth, Australia. Dijeron que debido a que la diferencia en el plasma Aβ42 entre los controles y las personas con amiloide positivo es tan pequeña para empezar, cualquier fenómeno biológico que influya en la concentración de Aβ en sangre podría inclinar la medición. Estos fenómenos incluyen presión arterial alta, diabetes e hipoxia, y factores del estilo de vida, como el ejercicio.

            Martins investigó el efecto de la actividad física en el plasma Aβ42 y obtuvo un resultado sorprendente. Aunque la evidencia es fuerte de que la actividad física puede proteger al cerebro de la demencia, entre todos los controles sanos en AIBL, aquellos que registraron una alta actividad física durante los siete días anteriores tenían menos Aβ42 en su plasma que aquellos que informaron una actividad baja o media. Se podría considerar que menos Aβ42 en plasma significa que estas personas tienen más amiloide en el cerebro que las personas que hacen menos ejercicio. "La tendencia es exactamente lo contrario de lo que cabría esperar", dijo Martins.

            La tendencia se mantuvo en los controles sanos que dieron negativo en la prueba de amiloide cerebral mediante PET, pero en las personas con amiloide positivo, la actividad física pareció no tener ningún efecto sobre el Aβ42 plasmático. Martins calificó los resultados de desconcertantes y supuso que el ejercicio podría promover la degradación del Aβ. “El mensaje para llevar a casa es que los factores del estilo de vida, en particular el ejercicio, pueden influir en los niveles plasmáticos de Aβ y deben controlarse”, dijo Martins.

            Esas preocupaciones motivaron un estudio en WashU, donde 1,000 personas con enfermedades comunes como hipertensión, cáncer y diabetes están siendo inscritas para monitoreo, extracciones de sangre periódicas y una tomografía por emisión de positrones con amiloide en un esfuerzo por aprender cómo varias afecciones de salud afectan su sangre Aβ42 / 40 ratios y su capacidad para predecir su amiloidosis cerebral.

            Mientras tanto, las empresas están presionando para comercializar los análisis de plasma. C2N y Shimadzu ya están vendiendo pruebas de especificaciones masivas a algunos grupos, y las otras compañías no se quedan atrás. Las apuestas son altas. Los análisis de plasma marcarán el comienzo de una nueva era de diagnóstico y pronóstico en el campo de la EA.Los científicos de la AAIC estaban entusiasmados con las perspectivas de realizar pruebas de detección de forma más eficaz y económica para los ensayos clínicos. Ellos prevén realizar ensayos más cortos con cambios en el Aβ plasmático como lecturas, o volver a miles de muestras de sangre almacenadas de ensayos anteriores para desentrañar los efectos biológicos que pueden haberse pasado por alto. Incluso las preguntas básicas como la incidencia de Alzheimer en los países en desarrollo serán más fáciles de responder con un análisis de sangre confiable.

            Bateman y Hansson destacaron los ahorros que ofrecen las pruebas de plasma. Bateman calculó que en un ensayo como el A4, que utilizó PET amiloide como criterio de inclusión, una prueba de plasma podría reducir el tiempo de detección de tres años a seis meses y reducir los costos diez veces. Hansson estimó que una prueba de plasma Aβ podría reducir a la mitad la cantidad de tomografías por emisión de positrones necesarias para inscribir a 1000 personas, lo que ahorra alrededor de $ 4 millones. Por su parte, Schott basó su estimación en un precio de $ 3,000 para una tomografía por emisión de positrones y un supuesto de $ 400 para un análisis de sangre, calculando un ahorro de alrededor de $ 3,5 millones para una prueba de 500 participantes.

            Ese supuesto de precio puede resultar optimista. En AAIC, las empresas comercializaban sus pruebas de plasma a clientes como la industria farmacéutica y grandes grupos académicos que están planificando ensayos de tratamiento y necesitan reducir los costos de detección. Las empresas están analizando lo que podrán cobrar, pero cuando se les preguntó sobre el precio, fueron prudentes. Cuando se les presionó, los representantes de Shimadzu admitieron que actualmente estaban vendiendo su servicio en Japón a un precio de lista de aproximadamente $ 1,000 por prueba y una tarifa negociada real de entre $ 500 y $ 900. Shimadzu tiene la intención de comenzar a vender para uso de investigación en los EE. UU. Este otoño. Sus representantes dijeron a Alzforum que la estructura de precios aún no estaba establecida, pero sería algo más baja que en Japón.

            Al igual que Shimadzu y Araclon, C2N vende su prueba como un servicio, donde el plasma se envía a su laboratorio central y se analiza en las máquinas de especificación de masa de la empresa. Los representantes de C2N dijeron a Alzforum que el precio actual para el uso farmacéutico y de investigación es de aproximadamente $ 700 por muestra. Como el de Shimadzu, se negocia. El precio de C2N varía según la cantidad de pruebas que se compren y si el cliente comparte datos que C2N podría usar en su solicitud para la aprobación de la FDA. C2N cuenta con la validación revolucionaria de la FDA para su ensayo Aβ en plasma de especificación de masa y está preparando una presentación de aprobación.

            "Esta es nuestra fiesta de presentación" Joel Braunstein de C2N dijo a Alzforum durante AAIC. “Nos estamos preparando para respaldar nuestro producto. Tenemos 30 reuniones aquí para ver qué precios consideran aceptables los grupos farmacéuticos y académicos. ¡Todos nos preguntan cuánto costará! Prevemos menos de $ 1,000 por analito ". Para obtener una sesión de preguntas y respuestas sobre el desarrollo de análisis de sangre sólidos en la enfermedad de Alzheimer, consulte la parte 10 de esta serie. —Tom Fagan y Gabrielle Strobel


            Glucosa en sangre baja

            La glucosa en sangre baja, o hipoglucemia, ocurre cuando la glucosa en sangre baja demasiado. La glucosa en sangre puede bajar si se salta una comida o si espera demasiado para comer. El ejercicio riguroso también disminuye la glucosa en sangre, así como el consumo de bebidas alcohólicas. Algunos medicamentos pueden hacer que baje la glucosa en sangre. Puede prevenir la hipoglucemia comiendo con regularidad. Si experimenta un nivel bajo de azúcar en la sangre, comer algunos caramelos duros, beber una taza de leche de 8 onzas o beber 1/2 taza de jugo de fruta puede elevar los niveles rápidamente.


            ¿Cuándo debe verificar sus niveles de glucosa en ayunas?

            Hable con su médico sobre la frecuencia con la que debe controlar su nivel de azúcar en sangre. Las pruebas dependerán del tipo de medicamento para la diabetes que tome, así como de su nivel general de glucosa (también conocido como nivel de A1C). Si es nuevo en el uso de la insulina, es probable que deba controlar su nivel de azúcar en sangre varias veces al día. Es posible que otras personas con diabetes solo necesiten controlar sus niveles unas pocas veces a la semana.

            Es posible que ocasionalmente necesite controlar su nivel de azúcar en la sangre en momentos que no estén relacionados con una comida o la hora de acostarse. Por ejemplo, si su médico ha realizado recientemente un cambio en su medicamento para la diabetes, es posible que le pida que controle su glucosa en sangre con más frecuencia durante el día para evaluar qué tan bien están funcionando sus nuevos medicamentos.

            También puede experimentar niveles elevados de azúcar en la sangre cuando está enfermo, ya que esto puede ser parte de la respuesta natural del cuerpo para combatir una infección, según los Institutos Nacionales de Salud. Si tiene un resfriado, por lo tanto, es posible que deba controlar sus niveles de azúcar en sangre con más frecuencia. La glucosa en sangre también puede elevarse durante el embarazo o en momentos de estrés.

            Si experimenta los síntomas de la hipoglucemia, controle su nivel de azúcar en sangre lo antes posible. Esta es la única forma de confirmar que es bajo, según la ADA.

            Sin embargo, no es una buena idea controlar su nivel de azúcar en sangre sin una razón clara. "Los puntos de datos significativos proporcionados por las lecturas de azúcar en sangre suelen estar vinculados a una comida", explica el Dr. Hafida. Controlar el azúcar en sangre al azar, especialmente directamente después de una comida, puede ser engañoso y puede hacer que ajuste su consumo de medicamentos o carbohidratos de manera incorrecta.