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¿Cuánto tiempo necesitan los diferentes mecanismos de regulación genética para que surtan efecto?

¿Cuánto tiempo necesitan los diferentes mecanismos de regulación genética para que surtan efecto?



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Estoy pensando en los principales mecanismos reguladores, como los factores de transcripción generales, los activadores, los represores y la interferencia del ARN.

Si se activaran genes reguladores no activos que utilizan cada uno de los diferentes mecanismos, ¿cuál sería el retraso (en promedio) entre la activación de cada uno de esos genes y su efecto regulador aguas abajo?


La gente suele decir de manera imprecisa que el tipo de regulación se lleva a cabo en el orden de varios minutos a horas, y eso puede ser lo más preciso posible dada la cinética variable de cualquier vía determinada.

Además, todos los genes en eucariotas requieren factores de transcripción generales, pero básicamente todos ellos también requieren que los activadores actúen primero para reclutar los GTF y los componentes modificadores de histonas (que permiten que los GTF y su ARN polimerasa amiga accedan a los genes). Por lo tanto, generalmente están aguas abajo de los activadores y su reclutamiento es parte de lo que contribuye a la cinética en los euakryotes.

Para el ARNi, la cinética de la caída en el ARNi podría depender en gran medida de la tasa de degradación de la proteína (que es ALTAMENTE variable). Incluso si elimina el ARNm, la proteína sigue ahí hasta que se degrada. Si normalmente se degrada rápidamente, la cinética de degradación del ARNm será limitante. Si es lento, entonces hay que esperar a que la proteína se degrade por sus mecanismos naturales (https://en.wikipedia.org/wiki/Proteasome).

Sigma dice que los efectos del ARNi se pueden ver en alrededor de 24 horas

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/learning-center/mission-sup-reg0/experimental-design0.html#s3

Thermo implica algo similar al decir que los efectos de ARNi se pueden ver durante 5-7 días después de la transfección (es decir, implican que se pueden ver después de un día).

https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/ambion-tech-support/rnai-sirna/tech-notes/duration-of-sirna-induced-silencing.html


Efectos de cuatro mecanismos reguladores diferentes sobre la dinámica de las cascadas reguladoras de genes

Las cascadas reguladoras de genes (GRC) son motivos comunes en las redes moleculares celulares. Una función lógica dada en estas cascadas, como la represión de la actividad de un factor de transcripción, puede implementarse mediante varios mecanismos reguladores diferentes. Las posibles consecuencias para el desempeño dinámico del GRC de elegir un mecanismo sobre otro no se han analizado sistemáticamente. Aquí, informamos la construcción de un GRC sintético en Escherichia coli, lo que nos permite por primera vez comparar y contrastar directamente la dinámica de cuatro mecanismos reguladores diferentes, que afectan la transcripción, traducción, estabilidad o actividad de un represor transcripcional. Desarrollamos un modelo matemático biológicamente motivado que es suficiente para reproducir la dinámica de respuesta determinada por mediciones experimentales. Utilizando el modelo, exploramos la dinámica de respuesta potencial que puede realizar el GRC construido. Llegamos a la conclusión de que las diferencias dinámicas entre los mecanismos reguladores en un paso individual en un GRC a menudo se ocultan en el rendimiento general del GRC y sugerimos que la presencia de un mecanismo regulador dado en un determinado entorno de red no significa necesariamente que representa un único óptimo. solución evolutiva.


Clase 13: Regulación genética

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Tópicos cubiertos: Regulación genética

Instructores: Prof. Eric Lander

Lección 10: Biología Molecular.

Clase 11: Biología Molecular.

Lección 12: Biología Molecular.

Clase 13: Regulación genética

Clase 14: Protein Localiz.

Clase 15: ADN recombinante 1

Clase 16: ADN recombinante 2

Clase 17: ADN recombinante 3

Clase 18: ADN recombinante 4

Clase 19: Ciclo / Signo celular.

Clase 26: Sistema Nervioso 1

Clase 27: Sistema Nervioso 2

Clase 28: Sistema Nervioso 3

Conferencia 29: Células Madre / Clon.

Clase 30: Células Madre / Clon.

Clase 31: Médico Molecular.

Clase 32: Evolucion Molecular.

Clase 33: Médico Molecular.

Clase 34: Polimorfo humano.

Clase 35: Polimorfo humano.

Buenos dias. Buenos dias.

Entonces, lo que me gustaría hacer hoy es retomar nuestro tema básico de biología molecular. Hemos hablado de la replicación del ADN.

La transcripción de ADN en ARN y la traducción de ARN en proteína. Discutimos la última vez algunas de las variaciones entre diferentes tipos de organismos: virus, procariotas, eucariotas, con respecto a los detalles de cómo lo hacen, en general, que las bacterias tienen cromosomas circulares de ADN, típicamente que los eucariotas tienen cromosomas lineales, etc. De lo que me gustaría hablar hoy es la variación, pero la variación no entre organismos sino dentro de un organismo de vez en cuando y de un lugar a otro, es decir, cómo es que algunos genes o actividades genéticas se activan, en algunas ocasiones, y se desactivan. otras ocasiones. Este es, obviamente, un problema muy importante para un organismo, particularmente para alguien como usted, que es un organismo multicelular y tiene el mismo conjunto de instrucciones de ADN en todas sus células.

Obviamente, es muy importante asegurarse de que el mismo código básico esté haciendo cosas diferentes en diferentes celdas.

También es importante para una bacteria asegurarse de que está haciendo diferentes cosas en diferentes momentos, dependiendo de su entorno. Entonces, voy a hablar de un sistema muy particular hoy como una ilustración de cómo se regulan los genes, pero antes de hacer eso, preguntemos, ¿dónde están los diferentes lugares en esta imagen?

El ADN va al ADN va al ARN va a las proteínas, en las que, en principio, podría regular la actividad de un gen. ¿Podrías regular la actividad de un gen cambiando realmente el ADN codificado en el genoma? ¿Entonces por qué no? ¿Porque que? Se convierte en un gen diferente. Sí, eso es solo una definición.

¿Por qué la célula no puede simplemente decidir que quiero que este gen cambie de alguna manera ahora? Oh, no lo sé, alteraré la secuencia de ADN de alguna manera. Y eso hará que el gen funcione.

¿Podría pasar eso? eso está permitido? Sí, resulta que sucedió.

No es lo más común, y no es de lo que hablarán mucho en los libros de texto, pero en realidad se puede hacer regulación.

Entonces, los niveles de regulación son muchos, y uno está en el nivel de reordenamiento del ADN. Como veremos más adelante en el curso, por ejemplo, su sistema inmunológico crea genes nuevos y funcionales reordenando localmente algunos fragmentos de ADN, algunas bacterias, particularmente los organismos infecciosos controlan si los genes se activan o desactivan al entrar realmente allí. y voltear un fragmento de ADN en su cromosoma.

Y así es como activan o desactivan el gen, si en realidad entran y cambian el genoma. Hay una proteína que cambia la orientación de un segmento de ADN. Ahora, estos son un poco raros, y no vamos a hablar mucho sobre ellos, pero debes saber que casi todo lo que puede suceder sucede y es explotado de diferentes maneras por los organismos.

Entonces, el reordenamiento del ADN ciertamente ocurre. Es raro, pero siempre es genial cuando sucede.

Entonces, es divertido de ver. Y algo como el sistema inmunológico no puede descartarse simplemente como una rareza. Eso es algo increíblemente importante. La forma más común se encuentra en el nivel de regulación transcripcional, donde si se realiza o no una transcripción, la forma en que se procesa puede ser diferente. En primer lugar, el inicio de la transcripción de que la ARN polimerasa debería sentarse en este gen en esta ocasión y comenzar a transcribirlo es un paso potencialmente regulable (sic) que tal vez solo active el gen de la beta-globina y alfa-globina que juntos producen los dos componentes de la hemoglobina, y solo los activarás en los glóbulos rojos, o precursores de glóbulos rojos, y eso podría hacerse al nivel de si haces o no el mensaje en El primer lugar. Ese es un lugar donde se puede hacer.

Otro lugar son las elecciones de empalme que realiza.

Con respecto a su mensaje, obtiene esto con varios exones potenciales diferentes, y puede regular cómo se usa este gen al decidir empalmarlo de esta manera, y omitir ese exón tal vez, o no omitir ese exón. Ese condimento alternativo es una forma poderosa de regular. Y luego, finalmente, también puede regular a nivel de estabilidad del ARNm.

Estabilidad significa la persistencia del mensaje, la degradación del mensaje. Podría ser que en ciertas celdas, el mensaje esté protegido para que permanezca más tiempo.

Y, en otras células, quizás, está desprotegido y se degrada muy rápidamente. Si se degrada muy rápidamente, no tiene la oportunidad de producir una proteína o tal vez no puede producir demasiadas copias de la proteína. Si persiste durante mucho tiempo, puede producir muchas copias de proteínas.

Todas esas cosas pueden ocurrir y ocurren. Luego, por supuesto, está la regulación a nivel de traducción.

Traducción, si le doy un ARNm, ¿se traducirá automáticamente? Tal vez la célula tenga una forma de secuestrar el ARN para aumentarlo de alguna manera, de modo que no llegue al ribosoma en algunas condiciones, y en otras condiciones sí llegue al ribosoma, o algunas formas de bloquearlo de otras maneras. que simplemente secuestrarlo, sino bloquear físicamente si este mensaje se traduce o no, resulta que hay una gran cantidad de eso. Nuevamente, no es el más común, pero estamos aprendiendo, particularmente en los últimos años, que la regulación de la traducción de un ARNm es importante.

Hay, aunque no hablaré de ellos en profundidad, un nuevo y emocionante conjunto de genes llamados micro ARN, pequeños ARN que codifican segmentos de 21-22 pares de bases que pueden emparejarse con un ARN mensajero e interferir parcialmente de alguna manera. con su traducibilidad. Y así, por el número y los tipos de pequeños micro ARN que se encuentran allí, los organismos pueden ajustar hacia arriba o hacia abajo qué tan activamente se está traduciendo un mensaje en particular.

Por tanto, la capacidad de regular la traducción de diferentes formas es importante. Y luego, por supuesto, está el control postraduccional. Una vez que se produce una proteína, puede ocurrir una regulación postraduccional.

Podría ser que la proteína esté modificada de alguna manera.

Las proteínas dicen que están completamente inactivas a menos que le pongas un grupo fosfato, y una enzima aparece y le pone un grupo fosfato. O está inactivo hasta que elimine el grupo fosfato.

Pueden ocurrir todo tipo de modificaciones postraduccionales en las proteínas después de que se forma la cadena de aminoácidos que pueden afectar si la proteína está activa o no. Cada uno de estos es potencialmente un paso por el cual un organismo puede regular si tiene o no una cierta actividad bioquímica presente en una cierta cantidad en un momento determinado. Y cada uno de estos se usa. La cuestión de llegar a un sistema que ha estado en proceso de evolución durante tres mil quinientos millones de años es que incluso las pequeñas diferencias pueden combatirse como ventajas competitivas y pueden ser reparadas por un organismo. Entonces, si una pequeña cosa comenzara a ayudar levemente al organismo, podría alcanzar la fijación. Y está llegando a este sistema, que ha tenido alrededor de tres mil quinientos millones de años de parches para el código de software, y tiene todo tipo de capas y regulaciones acumuladas encima. Todas estas cosas pasan. Pero, lo que creemos que es lo más importante de toda esta colección es este tipo.

El lugar fundamental en el que vas a regular si tienes o no el producto de un gen es si te molestas en transcribir su ARN. Pero quiero decir porque, ¿sí? ¿Y qué exones usaste y cuáles no? Sí, bueno, hay factores específicos de tejido que son específicos de un gen que pueden influir en eso. Y, sorprendentemente, se sabe poco sobre los detalles. Hay un par de casos en los que la gente lo sabe, pero como se imagina, en realidad necesita un sistema regulador en ese tejido para poder decidir omitir ese exón.

Y, sorprendentemente, la mecánica de eso se comprende en muy pocos casos. Y, podría pensar que a la evolución no le gustaría usar eso como lo más común porque realmente tiene que hacer algo especializado para hacer eso. Entonces, eso es lo que sucede con estos. Ese es uno en particular en el que creo que debe realizarse una gran cantidad de trabajo.

Estabilidad del ARNm, entendemos algunos de ellos, pero no todos los factores en este negocio. Les estaba hablando de que la traducción con estos pequeños micro-ARN es algo que en realidad tiene solo unos pocos años y que la gente ha llegado a comprender. Entonces, hay mucho que entender sobre estas cosas. Les voy a hablar sobre la iniciación de los ARNm, porque es el área donde más sabemos y creo que les dará una buena idea del paradigma general.

Pero cualquiera de ustedes que quiera profundizar en esto encontrará que todavía hay mucho más por descubrir sobre estas cosas.

Entonces, la cantidad de proteína que una célula puede producir varía enormemente.

Sus glóbulos rojos, el 80% de sus glóbulos rojos, proteína, es alfa o beta-globina. Es una cantidad enorme. Eso no es cierto en ninguna otra célula de su cuerpo. Entonces, estábamos hablando de rangos de diferencia bastante significativos en cuanto a la cantidad de proteína que se produce.

¿Cómo suceden cosas así? Bueno, voy a describir el caso más simple y clásico de regulación genética y bacterias, y en particular, el famoso operón carente de E. coli.

Entonces, este fue el primer caso en el que la regulación realmente se elaboró, y hoy es un muy buen paradigma de cómo funciona la regulación. E coli, para crecer, necesita una fuente de carbono. En particular, a la E. coli le gusta el azúcar.

Le gustaría tener un azúcar para crecer. Si se le da la opción, ¿cuál es el azúcar favorito de E. coli? Es glucosa, cierto, porque tenemos todo el ciclo de la glucosa. Toda la vía de la glucosa va hacia el piruvato, del que hemos hablado, y la glucosa es el azúcar preferido para entrar en esa vía, de acuerdo, de la glucólisis.

Glucólisis: descomposición de la glucosa. Pero supongamos que no hay glucosa disponible. ¿Está E coli dispuesta a consumir un azúcar diferente?

Seguro, porque la E. coli no es estúpida. Si rechazara otro azúcar, no podría crecer. Por lo tanto, tiene una variedad de vías que derivarán otros azúcares a glucosa, lo que luego le permitirá pasar por la glucólisis, etc. Ahora, dada la opción, preferiría usar la glucosa. Pero si no, suponga que le dio lactosa. La lactosa es un disacárido. Es el azúcar de la leche, y solo esbozaré brevemente, por lo que la lactosa es un disacárido donde tienes una glucosa y una galactosa.

Glucosa más galactosa es igual a lactosa. Por lo tanto, si se administra galactosa a E. coli, se puede descomponer en glucosa más galactosa.

Y lo hace mediante una enzima en particular llamada beta galactosidasa, que descompone los glactósidos. Y le dará galactosa más glucosa. ¿Cuánta beta-galactosidasa tiene alrededor una célula de E. coli? ¿Perdón? ¿Ninguno? Pero, ¿cómo lo hace?

Cuando lo necesite, lo sintetizará. Cuando lo necesita, como, no hay glucosa y hay mucha galactosa alrededor, ¿cuánta habrá? Mucho. Resulta que en circunstancias en las que E. coli depende de la galactosa como combustible, algo así como el 10% de la proteína total puede ser beta-gal en las circunstancias en las que se tiene galactosa pero no glucosa. ¿Perdón? Lo siento, cuando tienes lactosa pero no glucosa. Gracias. Entonces, cuando tiene lactosa pero no glucosa, E. coli tiene el 10% de su peso proteico en forma de beta-galactosidasa. Guau. Pero cuando tienes glucosa o no tienes lactosa, tienes muy poca.

Podría ser casi nada, trazas. Entonces, ¿por qué hacer esto?

¿Por qué no, por ejemplo, tener un compromiso mucho más razonable?

Por ejemplo, siempre tengamos solo un 1% de beta-galactosidasa.

¿Por qué necesitamos el 0-10%? En realidad, el 10% es extremadamente alto.

Y qué. Es una buena póliza de seguro. Entonces, si solo tengo galactosa, necesito más. Bueno, quiero decir, el 1% todavía lo digeriría. Todavía lo haré. ¿Cuál es el problema? ¿Perdón?

Entonces, lo hago a un ritmo más lento. La vida es larga. ¿Por qué no? Ah, tiene que competir. Entonces, si la célula de la izquierda tuviera una mutación que la hiciera producir cuatro veces más, entonces absorbería la lactosa en el ambiente, crecería más rápido, etc., etc., y podríamos haber competido.

Entonces, estas pequeñas mutaciones de sintonía tienen un gran efecto entre esta población competitiva de bacterias. Y entonces, si E. coli actualmente piensa que es realmente bueno tener casi no a veces y 10% en otras ocasiones, puede apostar a que se ha resuelto gracias a una competencia bastante rigurosa, que no quiere desperdiciar el energía produciendo esto cuando no la necesitas, y cuando la necesitas, realmente tienes que competir duro creciendo tan rápido como puedas cuando tienes esa lactosa alrededor. está bien. Entonces, ¿cómo consigue realmente la lactosa, lo siento, mantenme honesto sobre lactosa versus galactosa, en la célula? Resulta que también tiene otro producto genético, otra proteína, que es una lactosa permeasa. Y, ¿alguna conjetura sobre lo que hace una permeasa de lactosa? Hace que la célula sea permeable a la lactosa, bien. Entonces, la lactosa puede ingresar a la célula y luego la beta-gal puede descomponerla en galactosa más glucosa. Estas dos cosas, de hecho, se regulan, beta-gal y esta permeasa de lactosa. ¿Entonces, cómo funciona?

Echemos un vistazo ahora a la estructura del operón de falta.

Entonces, mencioné brevemente la última vez, ¿qué es un operón? Recuerde que dijimos que en las bacterias, a menudo se creaba una transcripción que tenía múltiples proteínas codificadas.

Se podría producir un solo ARNm, y podrían ocurrir múltiples inicios para la traducción, y podría producir múltiples proteínas.

Y esto sería bueno si quisiera producir un montón de proteínas que fueran parte de la misma vía bioquímica.

Tal objeto, un fragmento de ADN regulado que produce una transcripción que codifica múltiples polipéptidos, se llama operón porque funcionan juntos. Entonces, echemos un vistazo aquí al operón de falta. Dije que había un promotor.

Aquí hay un promotor para el operón, y lo llamaremos P falta, promotor del operón falta. Aquí está el primer gen que está codificado. Entonces, el mensaje comenzará aquí, en realidad por aquí, y comenzará a sonar. Y al primer gen se le da el nombre de falta Z.

Sucede que codifica la enzima beta-galactosidasa.

Recuerde, hicieron una búsqueda de mutantes, y cuando hicieron la búsqueda de mutantes, no sabían qué era cada gen, ya que aislaron mutantes.

Entonces, solo les dieron nombres de letras. Y entonces, se llama falta Z. Y, todo el mundo en biología molecular sabe que este es el gen de falta Z, aunque Z no tiene nada que ver con la beta-galactosidasa. Fue solo la carta que se le dio.

Pero está atascado. Lo siguiente es la falta Y.

Y eso codifica el permease. Y también hay falta A, que codifica una transacetilasa, y en lo que a mí respecta, puedes olvidarte de eso. Está bien, pero acabo de mencionar que está ahí, y en realidad produce tres polipéptidos.

No nos preocuparemos por eso, está bien, pero produce una transacetilasa, ¿de acuerdo? Pero no figurará en lo que vamos a hablar y, de hecho, se sabe muy poco sobre la transacetilasa. También hay otro gen del que necesito hablar, y está por aquí, y se llama falta I. Y también tiene un promotor, que podemos llamar PI, para el promotor por falta I.

Y esto codifica una proteína muy interesante.

Entonces, aquí tenemos un mensaje que codifica un polipéptido.

Este ARNm codifica un polipéptido. Es monocistrónico. Este tipo de aquí es un mensaje policistrónico. Tiene múltiples cystrons, que es el antiguo y polvoriento nombre de estas regiones que se tradujeron en proteínas distintas. Y entonces, ese es ese ARNm.

Entonces, falta I, esto codifica una proteína muy interesante, que se llama represor de falta. El represor de la falta, en realidad lo bajaré un momento, no es una enzima.

No es un canal de superficie propia para introducir galactosa.

Es una proteína de unión al ADN. Se une al ADN. Pero no es una proteína de unión a ADN inespecífica que se une a cualquier ADN antiguo.

Tiene una preferencia específica de secuencia.

Es una proteína que tiene una confirmación particular, una forma particular, un conjunto particular de aminoácidos que sobresalen, que se combinó en el surco principal del ADN de una manera específica de secuencia, de modo que le gusta particularmente reconocer una determinada secuencia de nucleótidos y se une allí. ¿Dónde está la secuencia específica de nucleótidos donde a este tipo le gusta unirse? Sucede que está ahí.

Y esto se llama secuencia del operador o sitio del operador.

Entonces, a esta proteína le gusta ir y unirse allí. Ahora, he dibujado esto, por cierto, de modo que este sitio del operador se superpone correctamente al sitio del promotor.

¿A quién le gusta enlazar en el sitio del promotor? Polimerasa de ARN.

¿Qué va a pasar si la proteína represora de la falta está ahí?

La ARN polimerasa no se puede unir. Es solo físicamente, bloqueado para que no se atasque. Entonces, examinemos algunos casos aquí.

Supongamos que miramos aquí a nuestro gen. Tenemos a nuestro promotor, P falta. Tenemos el sitio del operador aquí. Tenemos el gen de la falta Z aquí, y tenemos el represor de la falta, la falta yo, el represor sentado allí.

La polimerasa intenta llegar a esto y se bloquea.

Entonces, ¿qué pasará en términos de la transcripción del operón de falta: sin ARNm? Entonces, eso es genial.

Entonces, hemos resuelto un problema de inmediato.

Queremos estar seguros de que a veces no se producirá ARNm.

De esta manera, no desperdiciaremos energía metabólica, produciendo beta-galactosidasa. ¿Terminamos? ¿No? Por qué no.

A veces tenemos que producir beta-galactosidasa.

Entonces, tenemos que sacar a ese represor de allí. Bueno, ¿cómo va a salir el represor ahí? ¿Cuándo queremos que se apague el represor? Cuando hay lactosa presente.

Entonces, de alguna manera, necesitamos construir algún tipo de mecanismo sensorial elaborado que sea capaz de decir cuándo hay lactosa presente y enviar una señal a la proteína represora diciendo, oye, la lactosa está presente. La señal se transmite hasta la proteína represora y la proteína represora sale.

¿Qué tipo de mecanismo sensorial elaborado podría construirse?

¿Usar lactosa como qué? Entonces, esto es bastante simple.

¿Estás diciendo que solo tomes lactosa y quieres que la lactosa sea su propia señal? Entonces, si la lactosa se uniera al represor, el represor podría saber que hay lactosa alrededor.

Bueno, ¿qué haría si lactosa se uniera a él? ¿Perdón? ¿Por qué se caería? Sí. Más interesado en la lactosa.

Entonces, si es una sugerencia, esto es bueno. Me gusta el trabajo de diseño que se está llevando a cabo aquí. La sugerencia es que si la lactosa se une a esto aquí, se une a nuestro represor, se caerá porque está más interesado en la lactosa que en el ADN. Ahora bien, ¿cómo se transmite realmente el interés a algo material? Debido a que el nivel real de agrado o disgusto cognitivo por el ADN por parte de este polipéptido no está claro, es posible que se esté antropomorfizando ligeramente con respecto a esta cadena polipeptídica. Entonces, mecánicamente, ¿qué va a pasar? Forma. Sí, ¿forma? La confirmación del cambio, el acto de unión, el acto de unir lactosa crea algo de energía, puede cambiar la forma de la proteína, y esa forma de la proteína puede, en el proceso de moverse para unirse a la lactosa, puede des-menear alguna otra parte de ella. que ahora ya no se une tan bien al ADN. Eso es exactamente lo que sucede.

Buen trabajo. Entonces, ustedes han diseñado, de hecho, lo que realmente sucede. Lo que sucede es lo que se llama un cambio alostérico. Solo significa otra forma.

Entonces, simplemente cambia su forma, que cambia de forma al unirse a la lactosa. Y se cae porque es menos adecuado para unir esta secuencia de ADN en particular cuando está unido a la lactosa allí. Entonces, en este caso, en presencia de lactosa, la falta de yo no se une.

Y se transcribe el operón de falta. ¿Sí? UH oh. Muy bien, diseñadores, aquí tenemos un problema. Tienes un sistema tan genial, ¿verdad? Ibas a sentir lactosa.

La lactosa se iba a unir al represor de falta, cambiaría su caída de confirmación: uh-oh. Pero, como usted señala, ¿cómo va a obtener lactosa, porque no hay una permeasa de lactosa porque la permeasa de lactosa es producida por el mismo operón? Entonces, ¿qué pasa si, de hecho, en lugar de obtener una de estas cosas de DOD mill speck de algún represor que es absolutamente tan apretado que nunca se cae bajo ninguna circunstancia, qué pasa si construimos un represor ligeramente descuidado que ocasionalmente se cae, y ocasionalmente permite la transcripción del operón carente? Entonces, tendremos algunas trazas de permeasa alrededor. Con un poco de permeasa alrededor, entrará un poco de lactosa.

Y, siempre que entre incluso un poco de lactosa, ahora cambiará el equilibrio para que el represor se apague más y, por supuesto, eso hará más penetración, desplazamiento, desplazamiento, desplazamiento y desplazamiento. Entonces, siempre que no esté tan perfectamente diseñado como para que no se transcriba nada, ningún ARNm es realmente muy poco ARNm. Mira, esto es lo bueno, creo, de que los estudiantes del MIT aprendan estas cosas porque aquí hay todo tipo de principios de diseño maravillosos sobre cómo construir sistemas. Y creo que este es solo un muy buen ejemplo de cómo se construye un sistema como este.

Ahora, está bien, ahora tenemos la capacidad de tener falta y falta, y eso es falta, principalmente debido a su problema de permeabilidad: muy bien. Ahora, hagamos una pequeña digresión sobre, ¿cómo sabemos esto? Este tipo de razonamiento, ahora les he dicho la respuesta. Pero echemos un vistazo a la comprensión de la evidencia que le permite concluir esto.

Entonces, para hacer esto, y este es el famoso trabajo en biología molecular de Jacobin Manoux a finales de los años 50 por el que ganaron un Premio Nobel, querían recolectar algunos mutantes.

Recuerde, esto es antes del momento de la secuencia de ADN o algo por el estilo, y quería recolectar mutantes que afectaran este proceso.

Entonces, para recolectar mutantes que arruinaron la regulación, sabían que la beta-galactosidasa se producía en una cantidad mucho mayor si había lactosa. La dificultad con eso era que la E. coli de tipo salvaje, cuando no tenía lactosa produciría muy poco beta-gal, una unidad de beta-gal, y en presencia de lactosa, produciría mucho, llamémoslo 1, 00 unidades. de beta-gal. Pero, el problema de jugar con esto es que la lactosa cumple dos funciones diferentes.

La lactosa es tanto el inductor de la expresión del gen en virtud de la unión al represor, etc., etc.

Pero también es el sustrato de la enzima porque a medida que se produce la beta-galactosidasa, esta descompone la lactosa. Entonces, hay menos lactosa en la unión, y si realmente quisieras estudiar los controles reguladores, tienes el problema de que lo que induce al gen al unirse al represor es lo que está siendo destruido por el producto del gen. Por lo tanto, hará que la cinética de estudiar tal proceso sea realmente complicada. Sería muy bueno si pudiera producir una forma de lactosa que pudiera inducir beta-galactosidasa al unirse al represor, pero que no fuera digerida por sí misma.

Químicamente, de hecho, puedes hacer eso. Químicamente, es posible producir una molécula llamada IPTG, que es un análogo de galactósido. Y lo que hace es esta molécula aquí que voy a bosquejar muy rápidamente aquí, es un azufre allí, y pueden ver vagamente similar, esto puede ser un inductor.

Inducirá beta-gal, pero no un sustrato. No se digiere.

Por lo tanto, se mantendrá todo el tiempo que desee. También es muy conveniente utilizar una molécula que se desarrolló llamada ex-gal.

Ex-gal nuevamente tiene una fracción de azúcar, y luego también tiene este tipo de anillo doble divertido aquí, que es un cloro y un bromo, etc. Y este tipo aquí no es un inductor. No es capaz de inducirse, de inducir la expresión de beta-galactosidasa. Pero es un sustrato.

La enzima lo descompondrá y, de manera bastante ordenada, cuando se descomponga se volverá azul. Estos dos productos químicos resultaron ser muy útiles para tratar de resolver la regulación del operón de falta. Entonces, si yo, en lugar de agregar lactosa, si pienso en agregar IPTG, mi inductor, cuando agregue IPTG voy a producir beta-gal. Cuando no tengo IPTG, no produciré beta-gal. Pero entonces no tengo el problema de que esto se agote. Entonces, ¿qué tipo de mutante podría buscar? Podría buscar un mutante que incluso en ausencia del inductor, IPTG, todavía produzca una gran cantidad de beta-gal. Ahora, también puedo buscar mutantes que, pase lo que pase, nunca producen beta-gal, ¿verdad? Pero, ¿cuáles serían probablemente? Probablemente serían mutaciones estructurales que afectan la secuencia de codificación de beta-gal, ¿verdad? Eso sucederá.

Puedo recopilar mutaciones que hacen que la E. coli nunca produzca beta-gal. Pero eso no es tan interesante como recolectar mutaciones que bloquean la represión que causa que la beta-gal se produzca todo el tiempo. Entonces, ¿cómo encontraría a un mutante así?

Quiero encontrar un mutante que produzca una gran cantidad de beta-gal incluso cuando no haya IPTG. Entonces, coloquemos un poco de E coli en un plato. ¿Deberíamos poner IPTG en un plato? No, entonces no IPTG.

¿Qué busco? ¿Cómo puedo saber si alguno de estos chicos está produciendo una gran cantidad de beta-gal? ¿Sí?

Entonces, no IPTG, pero ponte ex-gal, y si alguien está produciendo una gran cantidad de beta-gal, ¿qué sucede? Se vuelven azules: es muy fácil atravesar una gran cantidad de E. coli como esa en busca de algo azul.

Y así, se recolectaron muchos mutantes que eran azules.

Y estos productos químicos todavía se utilizan en la actualidad. Se usan de forma rutinaria en laboratorios, ex-gal y cosas así, lo que hace que los errores se vuelvan azules porque ha resultado ser un sistema tan bien estudiado que lo usamos para muchas cosas. Entonces, se encontraron mutantes que eran constitutivos. Entonces, se encontraron mutantes que eran mutantes constitutivos. Mutantes constitutivos: es decir, expresar todo el tiempo, ya no regulados, por lo tanto, caracterizar a estos mutantes constitutivos.

Resulta que cayeron en dos clases diferentes de mutantes constitutivos. Si tuviéramos suficiente tiempo, y pudieras leer los periódicos y todo, lo que haría es darte las descripciones que Jacobin Maneaux tenía de estos divertidos mutantes que habían aislado y estaban tratando de caracterizar, y cómo descifrar qué era. pasando.

Pero es complicado y difícil, y te duele la cabeza si no sabes cuál es la respuesta. Entonces, primero les voy a decir la respuesta de lo que está sucediendo, y luego veré cómo sabrían que este fue el caso. Pero, imagina que no sabías esta respuesta y tuviste que descifrarla a partir de los datos.

Entonces, supongamos que lo hiciéramos, entonces, si hubiera dos tipos de mutantes: el mutante número uno son constituyentes operadores.

Tienen una secuencia de operador defectuosa. Se han producido mutaciones en el sitio del operador. El mutante número dos tiene una proteína represora defectuosa, el gen de la proteína represora.

¿Cómo puedo notar la diferencia?

Entonces, podría tener un problema en el sitio de mi operador.

¿Cuál sería el problema con el sitio del operador?

Alguna mutación en la secuencia hace que el represor ya no se una allí, ¿de acuerdo? Por lo tanto, un sitio de operador defectuoso no vincula a los represores. Represor defectuoso, el sitio del operador está bien, pero no tengo un represor para vincularlo. Entonces, ¿cómo puedo distinguir la diferencia? Una forma de notar la diferencia es comenzar a cruzar los mutantes con el tipo salvaje y preguntar, ¿son dominantes o recesivos, o cosas así?

Ahora, aquí hay un pequeño problema. E. Coli no es un diploide, por lo que no se pueden cruzar dos E. colis y hacer una E. coli diploide, ¿verdad? Es un procariota. Solo tiene un genoma. Pero resulta que puedes producir diploides temporales, diploides parciales de E. coli porque resulta que puedes aparear bacterias. Las bacterias, que tienen un cromosoma bacteriano aquí también se involucran en el sexo y, en el curso del sexo bacteriano, los plásmidos se pueden transferir llamados, por ejemplo, un factor F, pueden transferirse de otra bacteria. Y, a través de las maravillas del merodiploide parcial, puede contraer temporalmente E. colis, o puede contraer permanentemente E. colis, que son parcialmente diploides. Entonces, puedes hacer lo que voy a decir. Pero, en caso de que le preocupara que escribiera genotipos diploides para E. coli, puede hacerlo.

Puedes hacer diploides parciales. Entonces, probemos un genotipo aquí.

Supongamos que el represor es de tipo salvaje, el operador es de tipo salvaje y el gen de la falta Z es de tipo salvaje. Y supongamos que no tengo IPTG, no estoy inducido. Tengo una unidad de beta-gal. Cuando agrego mi inductor, ¿qué sucede? Consigo 1.000 unidades de beta-gal.

Ahora, supongamos que tendría una mutación constitutiva del operador.

Entonces, el sitio del operador está defectuoso. No ata al represor. Beta-gal se va a expresar todo el tiempo, incluso en ausencia. Muy bien, bueno, eso fue, por supuesto, para lo que seleccionamos. Ahora, supongamos que hice el siguiente diploide.

I más, O más, Z más, más de I más, O constituyente, Z más. Entonces, aquí está mi diploide. ¿Cuál sería el fenotipo? Entonces, en otras palabras, uno de los cromosomas tiene un problema de operador.

Bueno, eso significa que este cromosoma aquí siempre va a expresar constitutivamente beta-gal.

Pero, ¿qué pasa con este cromosoma aquí? No lo hará. Entonces, esto sería alrededor de 1, 01, más o menos, porque tiene un cromosoma haciendo eso y un cromosoma haciendo esto, y este sería alrededor de 2, 00. Ahora, esa diferencia cuantitativa no importa mucho. Lo que realmente vio cuando hizo la biología molecular fue que cuando tenía una copia de la mutación constitutiva del operador, todavía tenía una gran cantidad de beta-gal aquí incluso en ausencia de IPTG. Entonces, ese sitio constitutivo del operador parecía que era dominante en este sitio plus aquí.

Pero ahora, probemos este de aquí. I más, O más, Z más, más de I más, operador constitucional, Z menos. ¿Qué pasa entonces?

Este sitio constitutivo del operador permite la transcripción constante de esta copia en particular. Pero, ¿puede esta copia en particular hacer una beta-gal funcional y funcional? No. Entonces, esto parece, cuando haces tus cruces genéticos, encuentras que el operador constituyente, ahora, si invierto estos aquí, suponga que los invierto, I más, O más, Z menos, I más, O constitutivo, Z más, los mismos genotipos, cierto, excepto que cambié el cromosoma en el que están.

Ahora que pasa? Este cromosoma aquí: siempre produce beta-gal y funciona. Este cromosoma aquí: no produce beta-gal.

Aunque está regulado, es un mutante. Entonces, en otras palabras, a partir de este mismo experimento, puede decir que el sitio del operador solo está afectando el cromosoma en el que está físicamente, que no produce una proteína que flote.

Lo que hace es que se dice que funciona en cys. En cys significa en el mismo cromosoma. Trabaja físicamente en el mismo cromosoma.

Ahora, echemos un vistazo, por el contrario, a las propiedades de los mutantes represores de la falta. Si le doy un mutante represor carente, I plus, O plus, Z plus es el tipo salvaje.

I constitutivo, O plus, Z plus: ¿qué pasa aquí?

Este tipo salvaje es uno en 1, 00. Este tipo aquí: 1,000 y 1, 00, y luego veamos un diploide: I plus, O plus, Z plus, I constitative, O plus, Z plus. Cual es el efecto? El yo constitucional no hace un represor funcional. Pero, además, es un represor funcional. Entonces, ¿esto mostrará la regulación?

Sí, esto estará bien regulado. Esto funciona muy bien, y de hecho hará 2000, y hará dos copias allí.

Pero, de nuevo, las unidades no importan demasiado. Y, por el contrario, si le doy I más, O más, Z menos, y I constituyente, O más, Z más, ¿qué pasará?

Aquí tengo mi mutación en este cromosoma. Pero no importa porque tengo mi mutación en este cromosoma en el represor. Tengo una mutación en la falta Z aquí, pero mientras tenga una copia funcional, una copia funcional del represor de falta, funciona en ambos cromosomas.

Funcionará en ambos cromosomas, y en otras palabras, esta falta de represor, una copia funciona en ambos cromosomas. En otras palabras, hace un producto que se difunde y puede funcionar en cualquier cromosoma, y ​​se dice que funciona en trans, es decir, a través.

Entonces, el operador está trabajando en cys. Está operando solo en su propio cromosoma. Una mutación en el operador solo afecta al cromosoma en el que vive, mientras que una copia funcional del represor de falta flotará porque es una proteína, y así es como Jacobin Maneaux supo la diferencia.

Demostraron su modelo mostrando que estos dos tipos de mutaciones tenían propiedades muy diferentes. Las mutaciones del operador afectaron solo al cromosoma físico en el que ocurrieron, lo que, por supuesto, tuvieron que inferir de la genética que hicieron, mientras que el represor, un represor de copia funcional, podría actuar sobre cualquier cromosoma de la célula.

Entonces, está bien, lo tenemos. Ahora, último punto, ¿qué pasa con la glucosa?

No he dicho una palabra sobre la glucosa. Mira, esto fue un gran problema para la gente.

Este modelo, el modelo represor, tenemos este represor. ¿Qué pasa con la glucosa? ¿Qué hace la glucosa en esta imagen?

Entonces, control de glucosa: aquí está mi gen. Aquí está mi promotor, P falta. Aquí está mi operador, beta-gal.

Está codificado por falta Z. Tienes todo eso. Cuando este tipo está presente, lo siento, cuando hay lactosa, el represor sale. La polimerasa se sienta. Espere un segundo, se supone que la polimerasa no debe sentarse a menos que no haya glucosa.

Necesitamos otro sensor para saber si hay glucosa o si hay glucosa baja. Entonces, vamos a necesitar un sensor que diga eso. ¿Algunas ideas? ¿Sí?

Sí, si trabajas en eso, no creo que funcione del todo. Pero tienes la idea básica. Vas a querer otro algo, y resulta que hay otro sitio aquí, ¿de acuerdo? Hay un segundo sitio en el que se une una proteína completamente diferente.Y, esta proteína es la proteína reguladora de AMP cíclico, y sucede que en la célula, cuando hay bajas cantidades de glucosa, permítanme asegurarme de que lo hice bien, cuando hay bajas cantidades de glucosa, lo que tenemos es alto. cantidades de AMP cíclico. Resulta que el AMP cíclico, mientras que la lactosa se usa directamente como señal, el AMP cíclico se usa como señal aquí. Cuando la célula tiene cantidades bajas de glucosa, tiene grandes cantidades de AMP cíclico. Ahora, ¿qué quieres que haga tu AMP cíclico? ¿Cómo vamos a diseñar esto?

Se unirá a una proteína, proteína reguladora de AMP cíclico, se va a sentar, y ahora, ¿qué va a hacer?

¿Bloqueará la ARN polimerasa?

¿Qué queremos hacer? Si hay glucosa baja, AMP cíclico alto, nos sentamos en el sitio, queremos activar la transcripción ahora, ¿verdad? Entonces, lo que tiene que hacer no es bloquear la ARN polimerasa, sino ayudar a la ARN polimerasa. Entonces, lo que realmente hace es en lugar de ser un represor, es un activador. Y lo que hace es que resulta más atractivo para la ARN polimerasa unirse, y en realidad lo hace, en realidad lo hace ligeramente doblando el ADN.

Pero lo que hace es facilitar la unión de la ARN polimerasa.

Resulta que el promotor es una especie de promotor de mala muerte.

En realidad, es como recordar que el represor no era perfecto, el promotor tampoco es perfecto. El promotor es un poco miserable.

Y, a menos que la ARN polimerasa reciba un poco de ayuda de esta otra proteína reguladora, no funciona.

Tenemos dos controles: un regulador negativo que responde a una señal ambiental, un activador positivo que responde a una señal ambiental, ayudando a la polimerasa a decidir si transcribir o no, y básicamente así es como un óvulo humano llega a un adulto completo y vive toda su vida. menos algunos otros detalles. Quedan algunos detalles, pero ese es un bosquejo de cómo se activan y desactivan los genes.


32.1 Osmorregulación y equilibrio osmótico

En esta sección, explorará las siguientes preguntas:

  • ¿Por qué la osmorregulación y el equilibrio osmótico son importantes para las funciones corporales?
  • ¿Qué es la osmolaridad y cómo se mide?
  • ¿Qué son los osmorreguladores u osmoconformadores, y cómo estas herramientas permiten que los animales se adapten a diferentes entornos?

Conexión para cursos AP ®

Gran parte de la información de este capítulo no está dentro del alcance de AP ®. Sin embargo, el capítulo está lleno de ejemplos ilustrativos que son aplicables a conceptos que hemos explorado anteriormente, incluida la química, la estructura de la membrana de las células plasmáticas y el movimiento de moléculas a través de las membranas. Con esto en mente, es útil tener una comprensión general de cómo el cuerpo humano, específicamente el sistema excretor, mantiene la homeostasis osmótica a pesar de la influencia de factores externos como la temperatura, la dieta y las diferentes condiciones ambientales. Por ejemplo, si bebemos de ocho a diez vasos de agua por día, el cuerpo humano excreta esa agua a través de la micción, la defecación, la sudoración y, en pequeña medida, la respiración.

La información presentada y los ejemplos resaltados en la sección apoyan los conceptos descritos en la Gran Idea 2 del Marco del Currículo de Biología AP ®. Los Objetivos de Aprendizaje AP ® que figuran en el Marco del Currículo proporcionan una base transparente para el curso de Biología AP ®, una experiencia de laboratorio basada en la investigación, actividades de instrucción y preguntas del examen AP ®. Un objetivo de aprendizaje fusiona el contenido requerido con una o más de las siete prácticas científicas.

Gran idea 2 Los sistemas biológicos utilizan energía libre y bloques de construcción moleculares para crecer, reproducirse y mantener la homeostasis dinámica.
Comprensión duradera 2.B El crecimiento, la reproducción y la homeostasis dinámica requieren que la célula cree y mantenga ambientes internos que son diferentes de su ambiente externo.
Conocimiento esencial 2.B.1 Las membranas celulares son selectivamente permeables debido a su estructura.
Práctica de la ciencia 1.1 El estudiante puede crear representaciones y modelos de fenómenos y sistemas naturales o creados por el hombre en el dominio.
Práctica de la ciencia 7.1 El estudiante puede conectar fenómenos y modelos a través de escalas espaciales y temporales.
Práctica de la ciencia 7.2 El estudiante puede conectar conceptos en y entre dominios para generalizar o extrapolar en y / o a través de entendimientos duraderos y / o grandes ideas.
Objetivo de aprendizaje 2.11 El estudiante es capaz de construir modelos que conectan el movimiento de moléculas a través de las membranas con la estructura y función de la membrana.
Conocimiento esencial 2.B.2 El crecimiento y la homeostasis dinámica se mantienen mediante el movimiento constante de moléculas a través de las membranas.
Práctica de la ciencia 1.4 El alumno puede utilizar representaciones y modelos para analizar situaciones o resolver problemas de forma cualitativa y cuantitativa.
Objetivo de aprendizaje 2.12 El estudiante es capaz de utilizar representaciones y modelos para analizar situaciones o resolver problemas cualitativa y cuantitativamente para investigar si la homeostasis dinámica se mantiene mediante el movimiento activo de moléculas a través de las membranas.

La ósmosis es la difusión de agua a través de una membrana en respuesta a presión osmótica causado por un desequilibrio de moléculas a ambos lados de la membrana. Osmorregulación es el proceso de mantenimiento del equilibrio de sal y agua (equilibrio osmótico) a través de las membranas dentro de los fluidos corporales, que están compuestos de agua, además de electrolitos y no electrolitos. Un electrólito es un soluto que se disocia en iones cuando se disuelve en agua. A no electrolito, por el contrario, no se disocia en iones durante la disolución del agua. Tanto los electrolitos como los no electrolitos contribuyen al equilibrio osmótico. Los fluidos corporales incluyen el plasma sanguíneo, el citosol dentro de las células y el líquido intersticial, el líquido que existe en los espacios entre las células y los tejidos del cuerpo. Las membranas del cuerpo (como las membranas pleural, serosa y celular) son membranas semipermeables. Las membranas semipermeables son permeables (o permisivas) a ciertos tipos de solutos y agua. Las soluciones en dos lados de una membrana semipermeable tienden a igualar la concentración de soluto por el movimiento de solutos y / o agua a través de la membrana. Como se ve en la Figura 32.2, una celda colocada en agua tiende a hincharse debido a la ganancia de agua del ambiente hipotónico o "bajo en sal". Una célula colocada en una solución con mayor concentración de sal, por otro lado, tiende a hacer que la membrana se arrugue debido a la pérdida de agua en el ambiente hipertónico o "alto contenido de sal". Las células isotónicas tienen una concentración igual de solutos dentro y fuera de la célula, lo que iguala la presión osmótica a ambos lados de la membrana celular, que es una membrana semipermeable.

El cuerpo no existe aislado. Hay una entrada constante de agua y electrolitos en el sistema. Si bien la osmorregulación se logra a través de las membranas dentro del cuerpo, el exceso de electrolitos y desechos se transportan a los riñones y se excretan, lo que ayuda a mantener el equilibrio osmótico.

Necesidad de osmorregulación

Los sistemas biológicos interactúan e intercambian constantemente agua y nutrientes con el medio ambiente mediante el consumo de alimentos y agua y mediante la excreción en forma de sudor, orina y heces. Sin un mecanismo para regular la presión osmótica, o cuando una enfermedad daña este mecanismo, existe una tendencia a acumular desechos tóxicos y agua, lo que puede tener consecuencias nefastas.

Los sistemas de los mamíferos han evolucionado para regular no solo la presión osmótica general a través de las membranas, sino también las concentraciones específicas de electrolitos importantes en los tres compartimentos principales de líquidos: plasma sanguíneo, líquido extracelular y líquido intracelular. Dado que la presión osmótica está regulada por el movimiento del agua a través de las membranas, el volumen de los compartimentos de líquido también puede cambiar temporalmente. Dado que el plasma sanguíneo es uno de los componentes del líquido, las presiones osmóticas influyen directamente en la presión arterial.

Transporte de electrolitos a través de membranas celulares

Los electrolitos, como el cloruro de sodio, se ionizan en agua, lo que significa que se disocian en sus iones componentes. En el agua, el cloruro de sodio (NaCl) se disocia en el ion sodio (Na +) y el ion cloruro (Cl -). Los iones más importantes, cuyas concentraciones están muy estrechamente reguladas en los fluidos corporales, son los cationes sodio (Na +), potasio (K +), calcio (Ca +2), magnesio (Mg +2) y los aniones cloruro (Cl -), carbonato (CO3 –2), bicarbonato (HCO3 -) y fosfato (PO3 -). Los electrolitos se pierden del cuerpo durante la micción y la transpiración. Por esta razón, se anima a los atletas a reemplazar los electrolitos y líquidos durante los períodos de mayor actividad y transpiración.

La presión osmótica está influenciada por la concentración de solutos en una solución. Es directamente proporcional al número de átomos o moléculas de soluto y no depende del tamaño de las moléculas de soluto. Debido a que los electrolitos se disocian en sus iones componentes, en esencia, agregan más partículas de soluto a la solución y tienen un mayor efecto sobre la presión osmótica, por masa, que los compuestos que no se disocian en agua, como la glucosa.

El agua puede atravesar las membranas por difusión pasiva. Si los iones de electrolitos pudieran difundirse pasivamente a través de las membranas, sería imposible mantener concentraciones específicas de iones en cada compartimento de fluido, por lo que se requieren mecanismos especiales para cruzar las membranas semipermeables del cuerpo. Este movimiento se puede lograr mediante la difusión facilitada y el transporte activo. La difusión facilitada requiere canales basados ​​en proteínas para mover el soluto. El transporte activo requiere energía en forma de conversión de ATP, proteínas transportadoras o bombas para mover los iones en contra del gradiente de concentración.

Concepto de osmolalidad y milliequivalente

Para calcular la presión osmótica, es necesario comprender cómo se miden las concentraciones de solutos. La unidad para medir solutos es la Topo. Un mol se define como el peso molecular en gramos del soluto. Por ejemplo, el peso molecular del cloruro de sodio es 58,44. Por tanto, un mol de cloruro de sodio pesa 58,44 gramos. los molaridad de una solución es el número de moles de soluto por litro de solución. los molalidad de una solución es el número de moles de soluto por kilogramo de solvente. Si el solvente es agua, un kilogramo de agua es igual a un litro de agua. Mientras que la molaridad y la molalidad se usan para expresar la concentración de soluciones, las concentraciones de electrolitos generalmente se expresan en términos de miliequivalentes por litro (mEq / L): el mEq / L es igual a la concentración de iones (en milimoles) multiplicada por el número de electrolitos. cargas en el ion. La unidad de miliequivalente toma en consideración los iones presentes en la solución (ya que los electrolitos forman iones en soluciones acuosas) y la carga de los iones.

Por lo tanto, para iones que tienen una carga de uno, un miliequivalente es igual a un milimol. Para iones que tienen una carga de dos (como el calcio), un miliequivalente es igual a 0.5 milimoles. Otra unidad para la expresión de la concentración de electrolitos es el miliosmol (mOsm), que es el número de miliequivalentes de soluto por kilogramo de solvente. Los fluidos corporales generalmente se mantienen dentro del rango de 280 a 300 mOsm.

Osmorreguladores y osmoconformadores

Las personas que se pierden en el mar sin agua fresca para beber corren el riesgo de sufrir una deshidratación grave porque el cuerpo humano no puede adaptarse a beber agua de mar, que es hipertónica en comparación con los fluidos corporales. Los organismos como los peces de colores que pueden tolerar solo un rango relativamente estrecho de salinidad se denominan estenohalina. Aproximadamente el 90 por ciento de todos los peces óseos están restringidos al agua dulce o al agua de mar. Son incapaces de regulación osmótica en el entorno opuesto. Sin embargo, es posible que algunos peces como el salmón pasen parte de su vida en agua dulce y parte en agua de mar. Los organismos como el salmón y el molly que pueden tolerar un rango relativamente amplio de salinidad se denominan organismos eurihalinos. Esto es posible porque algunos peces han evolucionado. osmorregulador mecanismos para sobrevivir en todo tipo de ambientes acuáticos. Cuando viven en agua dulce, sus cuerpos tienden a absorber agua porque el ambiente es relativamente hipotónico, como se ilustra en la Figura 32.3.a. En ambientes tan hipotónicos, estos peces no beben mucha agua. En cambio, expulsan mucha orina muy diluida y logran el equilibrio electrolítico mediante el transporte activo de sales a través de las branquias. Cuando se trasladan a un ambiente marino hipertónico, estos peces comienzan a beber agua de mar y excretan el exceso de sales a través de sus branquias y su orina, como se ilustra en la Figura 32.3B. La mayoría de los invertebrados marinos, por otro lado, pueden ser isotónicos con el agua de mar (osmoconformadores). Sus concentraciones de fluidos corporales se ajustan a los cambios en la concentración de agua de mar. La composición de la sal de la sangre de los peces cartilaginosos es similar a la de los peces óseos; sin embargo, la sangre de los tiburones contiene los compuestos orgánicos urea y óxido de trimetilamina (TMAO). Esto no significa que su composición de electrolitos sea similar a la del agua de mar. Alcanzan la isotonicidad con el mar al almacenar grandes concentraciones de urea. Estos animales que secretan urea se denominan animales ureotélicos. TMAO estabiliza proteínas en presencia de niveles altos de urea, evitando la ruptura de enlaces peptídicos que ocurriría en otros animales expuestos a niveles similares de urea. Los tiburones son peces cartilaginosos con una glándula rectal para secretar sal y ayudar en la osmorregulación.

Conexión profesional

Técnico de diálisis

La diálisis es un proceso médico para eliminar los desechos y el exceso de agua de la sangre mediante difusión y ultrafiltración. Cuando falla la función renal, se debe realizar diálisis para eliminar artificialmente los desechos del cuerpo. Este es un proceso vital para mantener vivos a los pacientes. En algunos casos, los pacientes se someten a diálisis artificial hasta que son elegibles para un trasplante de riñón. En otros que no son candidatos para trasplantes de riñón, la diálisis es una necesidad de por vida.

Los técnicos de diálisis suelen trabajar en hospitales y clínicas. Si bien algunas funciones en este campo incluyen el desarrollo y el mantenimiento de equipos, la mayoría de los técnicos de diálisis trabajan en la atención directa al paciente. Sus deberes en el trabajo, que generalmente ocurren bajo la supervisión directa de una enfermera titulada, se enfocan en brindar tratamientos de diálisis. Esto puede incluir revisar el historial del paciente y su estado actual, evaluar y responder a las necesidades del paciente antes y durante el tratamiento, y monitorear el proceso de diálisis. El tratamiento puede incluir tomar e informar los signos vitales de un paciente y preparar soluciones y equipos para garantizar procedimientos precisos y estériles.

Conexión diaria para cursos AP®

Los pacientes sometidos a diálisis utilizan máquinas de diálisis como la que se muestra aquí. Su sangre corre a través de un tubo que está sumergido en una solución, y las paredes del tubo son en realidad membranas semipermeables. La solución está hecha para que la urea, el principal producto de desecho producido por los humanos, se extraiga de la sangre por difusión. La pared del tubo semipermeable permite el paso de la urea, pero mantiene los componentes más grandes de la sangre, como las proteínas y las células sanguíneas, dentro del tubo. La sangre "limpia" finalmente se devuelve al cuerpo.


Discusión

Proponemos un método estadístico PseudotimeDE para identificar genes DE a lo largo de pseudotime celular inferido. PseudotimeDE se enfoca en generar bien calibrados pag-valores teniendo en cuenta la aleatoriedad del pseudotiempo inferido. Para lograr estos objetivos, PseudotimeDE primero utiliza submuestreo para estimar la incertidumbre del pseudotime. En segundo lugar, PseudotimeDE ajusta el NB-GAM o ZINB-GAM tanto al conjunto de datos original como a los conjuntos de datos submuestreados permutados para calcular la estadística de prueba y sus valores nulos aproximados. A continuación, PseudotimeDE ajusta una distribución paramétrica para estimar la distribución nula aproximada del estadístico de prueba. Finalmente, PseudotimeDE calcula pag-valores con alta resolución. PseudotimeDE es flexible para adaptarse a pseudotime de celda inferido en un formato estándar por cualquier método. Su uso de NB-GAM y ZINB-GAM le permite capturar diversas dinámicas de expresión génica y adaptarse a una inflación cero no deseada en los datos.

Estudios exhaustivos sobre datos simulados y reales confirman que PseudotimeDE produce un mejor control de FDR y mayor potencia que los cuatro métodos existentes (tradeSeq, Monocle3-DE, NBAMSeq e ImpulseDE2). En datos simulados, PseudotimeDE genera bien calibrados pag-valores que siguen la distribución uniforme bajo la hipótesis nula, mientras que los métodos existentes excepto Monocle3-DE tienen pag-valores que violan el supuesto uniforme. Bien calibrado pag-valores garantizan el control FDR válido de PseudotimeDE. Además, gracias al uso de modelos flexibles NB-GAM y ZINB-GAM, PseudotimeDE tiene mayor potencia que Monocle3-DE, que utiliza un modelo GLM más restrictivo y por lo tanto tiene menos potencia. PseudotimeDE también supera a los otros tres métodos (tradeSeq, NBAMSeq e ImpulseDE2) que generan pag-valores en términos de potencia. En tres conjuntos de datos de scRNA-seq reales, los genes DE identificados de forma única por PseudotimeDE abarcan una mejor interpretabilidad biológica revelada por análisis funcionales, y el pag-Los valores de PseudotimeDE conducen a resultados GSEA más significativos.

Una pregunta interesante y abierta es qué método de inferencia pseudotime funciona mejor con PseudotimeDE. Si bien observamos que PseudotimeDE tiene mayor poder con Slingshot que con Monocle3-PI en los estudios de simulación, nos damos cuenta de que la razón puede estar asociada con el diseño de la simulación (por ejemplo, las estructuras de linaje) y, por lo tanto, no podemos sacar una conclusión de esta observación. . Debido a la diversidad de sistemas biológicos y la complejidad de la inferencia de pseudotime [9], decidimos dejar la elección de los métodos de inferencia de pseudotime abierta a los usuarios, y esta es la ventaja de que PseudotimeDE es flexible para acomodar pseudotimeDE inferido por cualquier método. En la práctica, animamos a los usuarios a que prueben los métodos populares de inferencia de pseudotime y utilicen PseudotimeDE como paso posterior para identificar genes DE, de modo que puedan analizar los resultados de identificación y decidir qué método de inferencia de pseudotime es más apropiado para su conjunto de datos.

El problema de la inflación cero, o "deserción", sigue siendo desconcertante y controvertido en el campo de las unicelulares [40-44]. La controversia es sobre si los ceros en exceso que no pueden ser explicados por Poisson o distribuciones binomiales negativas son biológicamente significativos o no. Frente a esta controversia, proporcionamos dos modelos en PseudotimeDE: NB-GAM y ZINB-GAM, donde el primero trata los ceros en exceso como biológicamente significativos y el segundo no. Específicamente, la distribución binomial negativa en NB-GAM se ajusta a todos los recuentos de expresión génica, incluido el exceso de ceros, mientras que el ajuste de la distribución negativa en ZINB-GAM excluye el exceso de ceros, que ZINB-GAM trata implícitamente como ceros no biológicos. PseudotimeDE permite que la elección entre los dos modelos sea especificada por el usuario o basada en datos.A partir de nuestro análisis de datos, nos damos cuenta de que la elección a menudo requiere un conocimiento biológico del conjunto de datos que se analizará. Específicamente, en el conjunto de datos de células dendríticas de LPS y el conjunto de datos de maduración de células beta pancreáticas, observamos que ZINB-GAM conduce a una pérdida de potencia: algunos genes DE potenciales no pueden ser identificados por ZINB-GAM porque los recuentos cero contienen información útil (Archivo adicional 1: Figs . S15-S18). Nuestra observación concuerda con otro estudio reciente [42], cuyos autores observaron que "los modelos inflados con cero conducen a tasas más altas de falsos negativos que los modelos idénticos no inflados con cero". Por lo tanto, nuestros resultados de análisis de datos reales se basan en NB-GAM. Sin embargo, al darnos cuenta de la complejidad de los sistemas biológicos y los protocolos scRNA-seq, dejamos la opción entre NB-GAM y ZINB-GAM como una opción para los usuarios de PseudotimeDE, y alentamos a los usuarios a trazar sus genes DE conocidos como en el archivo adicional 1: Higos. S15-S18 para decidir cuál de NB-GAM y ZINB-GAM captura mejor la dinámica de expresión génica de su interés.

La implementación actual de PseudotimeDE se limita a identificar los genes DE que tienen cambios de expresión dentro de un linaje celular. Si bien los métodos que incluyen GPfates [45], Monocle2 BEAM [46] y tradeSeq pueden probar si el cambio de expresión de un gen está asociado con un evento de ramificación que conduce a dos linajes, no consideran la incertidumbre de la inferencia del linaje. Cómo dar cuenta de tal incertidumbre topológica es una pregunta abierta desafiante, como hemos visto en las Figs. 2f y 6b que el linaje inferido puede variar de una topología de bifurcación a una topología de trifurcación en diferentes subconjuntos de células. Una posible dirección es utilizar la inferencia selectiva [47, 48], y dejaremos la investigación de esta cuestión para futuras investigaciones. Debido a este problema de incertidumbre de la topología, PseudotimeDE es más adecuado para datos de expresión génica de una sola célula que contienen solo un linaje celular (incluidos los datos cíclicos) o una pequeña cantidad de linajes celulares bien separados (por ejemplo, bifurcación y trifurcación). La razón es que estos datos pueden mantener una topología celular inferida estable después del submuestreo, un requisito esencial de PseudotimeDE. Dicho esto, PseudotimeDE no está diseñado para datos con muchos linajes celulares equívocos o una jerarquía celular compleja, los datos que no pueden mantener una topología celular inferida estable entre submuestras, porque para tales datos, es difícil encontrar coincidencias uno a uno entre las celdas linajes inferidos de una submuestra y aquellos inferidos de los datos originales. Entonces, una solución práctica para tales datos es definir primero un linaje celular de interés y luego aplicar PseudotimeDE solo a las celdas asignadas a ese linaje.

Hay otras preguntas abiertas por explorar. Una pregunta importante es: ¿cuándo queremos identificar los genes DE a lo largo del pseudotiempo? Como hemos mostrado en la sección "Resultados", el pseudotiempo inferido puede ser muy incierto. Como los biólogos a menudo secuencian células en múltiples puntos de tiempo físicos si quieren investigar un proceso biológico, un análisis sencillo es identificar los genes DE que tienen cambios de expresión en los puntos de tiempo físicos. Luego, tenemos dos definiciones de genes DE: los genes cuya expresión cambia a lo largo del pseudotiempo frente al tiempo físico. Entender qué definición es más relevante desde el punto de vista biológico es una cuestión abierta. Otra cuestión es si es posible integrar el pseudotiempo con el tiempo físico para identificar genes DE biológicamente relevantes. Responder a cualquiera de las preguntas requiere una formulación estadística que esté directamente relacionada con una pregunta biológica.

Otra cuestión es cómo explorar las correlaciones gen-gen a lo largo del pseudotiempo celular. Los métodos actuales de ED solo detectan cambios marginales en la expresión génica, pero ignoran las correlaciones gen-gen. No está claro si las correlaciones gen-gen son estables o varían a lo largo del pseudotiempo celular. Por lo tanto, un nuevo método estadístico para detectar cambios en la correlación gen-gen a lo largo del pseudotime inferido puede ofrecer nuevos conocimientos biológicos sobre la coexpresión y regulación de genes en la resolución unicelular.


Discusión

En este estudio, hemos combinado los enfoques de dos líneas de investigación previamente separadas. El concepto de red neutral se ha utilizado para abordar cuestiones evolutivas como la relación entre la robustez mutacional y la innovación (Smith, 1970 Schuster et al, 1994 Ciliberti et al, 2007). Aquí, hemos adaptado el enfoque para centrarnos en una cuestión diferente: la relación entre el diseño de red (topología de motivos) y el mecanismo dinámico (Ma et al, 2006 Hornung y Barkai, 2008). En lugar de considerar las topologías como una lista o conjunto, creamos un atlas de complejidad utilizando la noción de vecindario y el concepto de que las topologías mínimas representan mecanismos centrales (Salazar-Ciudad et al, 2000 Munteanu y Solé, 2008). Las estalactitas emergen naturalmente de este enfoque, y hemos demostrado que aunque la topología del núcleo por sí sola es insuficiente para definir un mecanismo dinámico (Figura complementaria S8), las estalactitas pueden corresponder a una clasificación de mecanismos. Aunque los diferentes mecanismos se asignan a regiones separadas del espacio de parámetros subyacente, los métodos más convencionales no lograron encontrar estas clases de mecanismos (Figura complementaria S6). Por lo tanto, creemos que el atlas de complejidad es un concepto poderoso, que será aplicable a muchos otros estudios de mecanismo de red.

Con esta nueva herramienta, hemos descubierto el primer caso de una función biológica bien definida para la que existen al menos seis mecanismos de tres genes diferentes. Estos probablemente representan las principales clases de diseño de redes (sistemas dinámicos) importantes para el problema de la interpretación del gradiente de morfógenos (Figura 5), ​​y se pueden agregar al repertorio de posibles mecanismos de formación de franjas, para ayudar a nuestra comprensión de los sistemas de modelos reales (Lander, 2007). Predecimos que esos mecanismos no descritos para la interpretación de morfógenos, a saber (C, D y E), también serán la base de los sistemas biológicos reales. El descubrimiento de que cinco de los seis mecanismos son autónomos de la célula refuerza la visión emergente de que las redes de factores de transcripción reguladores cruzados pueden estar en el corazón de muchos sistemas reales, como se ha propuesto para SHH (Dessaud et al, 2008). Curiosamente, se ha demostrado recientemente en el sistema Wingless del Drosophila disco imaginal ala que la comunicación local célula-célula es esencial para la correcta interpretación del morfógeno (Piddini y Vincent, 2009). Nuestro estudio predice que la comunicación local célula-célula rara vez será responsable de la respuesta dependiente de la dosis de las redes de interpretación de morfógenos. Demostramos que es más probable que esté involucrado en proporcionar robustez o precisión de ruido al sistema, en lugar de su funcionalidad subyacente.

Finalmente, se demostró previamente el poder de tales mapas de topología de funciones para discernir la topología de red subyacente y el mecanismo de una función (Ma et al, 2009). Sin embargo, estos mapas hasta ahora solo han demostrado la existencia de uno o dos mecanismos que son capaces de generar una función determinada. Por el contrario, los resultados presentados aquí advierten que algunas funciones biológicas bien definidas pueden poseer una amplia gama de explicaciones dinámicas alternativas (incluso para redes de tres genes relativamente simples y un formalismo de modelado limitado) como se demuestra en la Figura 5. Esta característica predicha ha beneficios potenciales, así como advertencias. Sugiere que en biología sintética existirá una variedad de formas diferentes de diseñar un circuito para realizar una función deseada, lo que brinda una mayor variedad de opciones entre las que elegir el diseño más práctico.


Desmentido: Bruce Lipton y la biología de las creencias

Su primera afirmación de que las mutaciones no son aleatorias no tiene evidencia alguna que la respalde. En su Evolución espontánea libro, señala un artículo publicado en Naturaleza en 1988 escrito por John Cairns. El artículo describe un experimento en el que E. coli con un gen mutante defectuoso para descomponer la lactosa se coloca en un medio que no contiene nada más que lactosa. Los resultados fueron que las bacterias habían mutado y pudieron descomponer la lactosa y crecer. Cairns concluyó que la mutación no fue aleatoria y Lipton afirma que podemos hacer cosas similares cuando nuestra salud está comprometida. Esta idea tiene enormes problemas porque no solo el experimento fue defectuoso, sino que hay explicaciones perfectamente buenas. Todo esto se discute bastante a fondo en Wiki.

La segunda afirmación de Lipton es de donde provienen la mayor parte de sus ideas. Afirma que, dado que las proteínas controlan la expresión génica, de alguna manera tenemos poder sobre ese mecanismo con nuestra conciencia y procede a contar historias de curas milagrosas a través de la hipnosis y la meditación que probablemente se pueden explicar por casos de diagnóstico erróneo o una recuperación muy afortunada. El problema aquí es que las proteínas se fabrican con instrucciones del ADN y proteínas específicas regulan la expresión de ciertos genes. Sin gen, sin proteína reguladora, por lo que los genes controlan indirectamente su propia expresión. Como se discutió en el punto anterior, los cambios en el ADN son aleatorios, por lo que no podemos controlar qué gen va a cambiar para producir qué proteína a menos que usemos ingeniería genética. La idea errónea viene con la epigenética. Los cambios epigenéticos más dramáticos son permanentes y ocurren temprano en el desarrollo. Los cambios epigenéticos en las personas maduras suelen ser superficiales, como los cambios en el color de los ojos, los niveles hormonales, el ciclo del sueño y otros procesos que ya están muy autorregulados. Se puede leer más sobre ese tema aquí y aquí. Lipton afirma que estos procesos de alguna manera pueden controlarse con nuestras creencias y usarse para desbloquear el ADN que puede ayudarnos a vivir de manera saludable y pacífica sin la ayuda del gobierno o de las compañías farmacéuticas. Un clásico vendedor de aceite de serpiente que vende falsas esperanzas a pacientes enfermos.

Jay_Bee

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Aún no lo he comprobado para obtener detalles, ciertamente podría estar promocionando la ciencia y extendiéndola más allá de lo que se justifica. La meditación a largo plazo conduce a cambios anatómicos en el cerebro que pueden medirse mediante diversas tecnologías de exploración (resonancia magnética, resonancia magnética funcional, etc.). La meditación reduce el cortisol y aumenta la melatonina, y esto cambia el patrón de expresión genética. Aquí hay un estudio de la parte superior de la pila que muestra que los genes responsables de producir algunas moléculas muy inflamatorias se pueden reducir mediante la meditación: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22795617

Aquí está uno de mis estudios favoritos relacionados con este tema: & quot; Análisis de estado exprimido cuántico de la emisión espontánea de fotones de luz ultra débiles de practicantes de meditación y sujetos de control & quot; ¡Las personas que meditan arrojan menos fotones! Creo que este efecto es muy real, pero la interpretación del estudio requiere investigación y reflexión adicionales; sería incorrecto saltar a muchas de las conclusiones cuasirreligiosas, como han hecho algunos. ¡Pero la meditación (y el ejercicio y la dieta) pueden cambiarte, incluso a nivel cuántico! http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18697618

Dan Wilson

Miembro senior.

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Huésped

Mick West

Administrador

Cairenn

Miembro senior.

SIENTO que una actitud positiva es útil en muchas enfermedades. Dudo que "vuelva a cablear" el ADN. Mi pensamiento es que reduce las hormonas del estrés y, por lo tanto, su propio sistema inmunológico puede combatir la enfermedad.

Es cierto que incluso muchos cánceres, nunca llegan a convertirse en potencialmente mortales. Podemos ver los problemas que estamos teniendo con las pruebas de cáncer de próstata.

Dan Wilson

Miembro senior.

Dan Wilson

Miembro senior.

Bueno, sí. Hay muchos factores que intervienen en una enfermedad. Estos sistemas biológicos son muy complejos. Por ejemplo, desarrollar cáncer es un juego de azar en el que las probabilidades las deciden los genes y el daño que sufre su ADN debido a las elecciones de su estilo de vida. Sin embargo, a pesar de tener cuidado, las personas aún pueden desarrollar cáncer debido a una mutación aleatoria. La suerte en la recuperación también tiene elementos de suerte. El sistema inmunológico de algunas personas está mejor preparado para destruir las células cancerosas y cosas que no entendemos completamente suceden para crear esa rara recuperación de & quot; milagro & quot. Una especie de recuperación que no podemos prometer le sucederá a todo el mundo. El ejemplo del cáncer aquí es muy complejo y se está trabajando mucho para comprenderlo.

Cairenn

Miembro senior.

En los perros, el ácaro de la sarna demodex se encuentra en la mayoría de los perros (y la mayoría de las personas también lo tienen). El sistema inmunológico del perro (y el nuestro mantiene estos ácaros bajo control). Sin embargo, cuando el sistema inmunológico está debilitado, la sarna puede causar problemas en la piel.

Hasta cierto punto, lo mismo ocurre con el ácaro que causa la sarna sarcóptica en los perros y la sarna en los humanos.

SR1419

Miembro senior.

^ A mi perro le dio sarna desmodactica cuando era un cachorro; perdió el pelo alrededor de uno de sus ojos. aspecto gracioso (volvió a crecer).

No registrado

Huésped

En primer lugar, creo que hacer referencia a una página wiki que tiene un gran aviso arriba diciendo que tiene problemas y que le faltan citas no es un buen comienzo para desacreditar ninguna teoría. Su argumento es interesante y tiene mérito.

Pero tengo que estar de acuerdo en que ha habido demasiados casos de "fallas diagnosticadas" y "recuperaciones muy afortunadas" para permitir que su argumento quede sin respuesta. Sí, quizás no podamos cambiar nuestro ADN con nuestras mentes. Pero hay algo ahí. La gente en todas partes parece estar sanando a sí misma de una serie de enfermedades y enfermedades potencialmente mortales.

Por supuesto, desacredite, pero presente un mejor argumento que la suerte de una persona que está en el quid de su argumento.

No registrado

Huésped

Teniendo en cuenta la gran cantidad de literatura científica a la que se hace referencia en los libros del Sr.Lipton que sirven para respaldar milenios de tradiciones y enseñanzas médicas orientales, así como la falta de apoyo informativo que usted mismo brinda para todas sus 'desacreditaciones', me sorprende que alguien lo tome seriamente. Bruce Lipton hace un muy buen trabajo explicando la teoría de la energía cuántica a las mentes occidentales y, aunque puede ser nueva para usted y para innumerables asociaciones y pensadores occidentales `` acreditados '', merece un gran respeto por escribir un libro tan completo sin criticar su oponentes, un respeto que rara vez se le otorga.

Esta es información que ha sido enseñada a lo largo de los siglos, ya sea por los antiguos yoguis, maestros de Shaolin o Zen, u otros maestros y curadores culturales, todos los que tienen la capacidad innata de comprender la enfermedad y el bienestar de una manera que nuestros médicos con licencia nunca pudieron. ¿Y te quedas aquí y lo refutas con divagaciones ignorantes? Una vez se me señaló que el sistema médico alopático occidental es el único sistema de curación en el mundo que se niega a aceptar la energía vital inherente a todos los seres vivos y entornos. Piense en eso por un momento.

¿Incluso leíste el libro? O tal vez lo hojeó, leyendo los resúmenes y las interpretaciones de otras personas antes de sonar en la pizarra aquí. Cualquiera que realmente leyera el libro y buscara comprender la información presentada dentro de las páginas no podía, mientras mantenía la cara seria, criticar a Bruce Lipton y su investigación o tratar de socavar sus teorías.

Una opinión equilibrada mostrará mucha más verdad que una sesgada. Quizás debería intentar apuntar a los cimientos sobre los que se construyen actualmente sus propias creencias con la misma agresión implacable que dispara contra las teorías del Sr. Lipton. Si sus creencias actuales se mantienen bajo tal fuego, como lo hace la verdad de la ciencia del Sr. Lipton independientemente de los golpes y desacreditaciones que se le presenten, entonces creo que está libre de continuar diciendo lo que piensa como lo hace. Si no es así, tal vez deba volver a examinar sus propias creencias y no las del Sr. Lipton.

No registrado

Huésped

Quantumbeliever

Prohibido

Mick West

Administrador

También afirma que caminar sobre el fuego es "la mente sobre la materia", cuando todo lo que es es termodinámica. Hace que sea difícil tomarlo en serio.

Estoy seguro de que queda una gran cantidad de conocimientos por descubrir. Sin embargo, lo único que hace Lipton es especular.

No registrado

Huésped

Mick West

Administrador

MikeC

Cuenta cerrada

Sí, lo hice yo mismo hace un par de décadas, estuvo bien, excepto que puse mi talón en un suelo blando al final de las brasas y una ceniza caliente cayó de la `` cama '' y se alojó contra mi tendón de Aquiles por un segundo causando una ampolla.

Yo había ayudado a construir el lecho de brasas, estaba hecho de leña local estándar, pinus radiata, que se construyó en una pira y luego se rastrilló sobre un lecho de arcilla preparado cuando dejó de arder.

No se requirieron drogas, meditación o medicina de ningún tipo para que mis plantas salieran ilesas al caminar alrededor de 6 pies, ni nada excepto un yeso y alrededor de una semana para que sane la quemadura en mi talón.

Dan Wilson

Miembro senior.

Cairenn

Miembro senior.

Otro problema que parece que siempre se pasa por alto con las personas que solo quieren "medicinas naturales", es el impacto que tendría en el medio ambiente su cultivo / recolección. Ya podemos ver los problemas con el ginseng americano. ¿Te imaginas quitar la corteza de los sauces en lugar de la aspirina cultivada en laboratorio?

Creo que mi mejor amiga finalmente entrenó a la gente que trabaja en el jardín para que NO rocíe los dientes de león con herbicida. Ella los quiere. Ella es una buena herbolaria e incluso tiene una 'habitación tranquila' con cosas que se están secando en ella.

Dan Wilson

Miembro senior.

De hecho, afirma en sus libros que podemos cambiar nuestro ADN. Se han realizado muchas investigaciones sobre qué influye en las proteínas y su forma. Decir que los campos cuánticos pueden cambiarlos y que nosotros cambiamos los campos cuánticos es una afirmación audaz de la que no creo que exista ninguna evidencia. La física newtoniana tiene poco o nada que ver con la forma en que las moléculas orgánicas interactúan y reaccionan entre sí. No me sorprende que puedan predecir su movimiento con la física cuántica porque la física cuántica describe la física de cosas muy pequeñas, a diferencia de la física newtoniana que se aplican mucho mejor al mundo macroscópico. Que yo sepa, la física cuántica ya ha beneficiado a la medicina al emplear métodos de láseres, nanopartículas y una computación mucho mejor. De ninguna manera influir en los campos. Sin embargo, la física cuántica no es mi área de especialización, y si cree que hay evidencia de que el campo cuántico está influyendo en nuestra salud de una manera en que podemos influir en nosotros mismos, publíquelo.

Por supuesto que no es perfecto, pero necesitas mucha evidencia si quieres cambiarlo. No todas las nuevas ideas radicales que desafían la comprensión actual son buenas. La mayoría son realmente malos.

RolandD

Miembro activo

Otro problema que parece que siempre se pasa por alto con las personas que solo quieren "medicinas naturales", es el impacto que tendría en el medio ambiente su cultivo / recolección. Ya podemos ver los problemas con el ginseng americano. ¿Te imaginas quitar la corteza de los sauces en lugar de la aspirina cultivada en el laboratorio?

Creo que mi mejor amiga finalmente entrenó a las personas que trabajan en el jardín para que NO rocíen los dientes de león con herbicidas. Ella los quiere. Ella es una buena herbolaria e incluso tiene una 'habitación tranquila' con cosas que se están secando en ella.

Cairenn

Miembro senior.

Uno de mis favoritos es la gente que parece pensar que cultivar cáñamo es la cura para todo. El aceite de cáñamo puede reemplazar la gasolina, la fibra de cáñamo se puede usar en lugar de los plásticos y, para el padre, la semilla de cáñamo es una gran fuente de nutrición. Uno de sus 'puntos de venta' es que 'el cáñamo crecerá en todas partes', y puedes obtener múltiples cosechas cada año.

Lo investigué, según la Asociación canadiense de productores de cáñamo. El cáñamo comercial requiere una buena tierra (igual a la que se necesita para el trigo o el maíz), fertilizantes e irrigación o buenas lluvias. Solo unas pocas áreas de los EE. UU. Tendrían una temporada de crecimiento lo suficientemente larga para más de una cosecha. Opps,

Pete Tar

Miembro senior.

Pensé que el cáñamo tenía potencial para cultivarse como planta de limpieza de tratamiento de aguas residuales.

¿Pero eso proporcionaría lo suficiente para hacer todas esas cosas?

No registrado

Huésped

Uno de mis favoritos es la gente que parece pensar que cultivar cáñamo es la cura para todo. El aceite de cáñamo puede reemplazar la gasolina, la fibra de cáñamo se puede usar en lugar de los plásticos y, para el padre, la semilla de cáñamo es una gran fuente de nutrición. Uno de sus 'puntos de venta' es que 'el cáñamo crecerá en todas partes', y puedes obtener múltiples cosechas cada año.

Lo investigué, según la Asociación canadiense de productores de cáñamo. El cáñamo comercial requiere una buena tierra (igual a la que se necesita para el trigo o el maíz), fertilizantes e irrigación o buenas lluvias. Solo unas pocas áreas de los EE. UU. Tendrían una temporada de crecimiento lo suficientemente larga para más de una cosecha. Opps,

No registrado

Huésped

Cairenn

Miembro senior.

Primero, no soy un hermano. En segundo lugar, he hecho bastante. Me interesé después de leer "No es asunto de nadie" de Peter McWilliams. No solo miré los sitios profesionales de cáñamo, parecía que tenía tierra y quería saber si el cáñamo sería una buena cosecha para cultivar.

Aquí está algo de lo que encontré. Es posible que notes que ninguno de ellos es un sitio anti cáñamo.

El cáñamo industrial se puede cultivar en una amplia variedad de tipos de suelo. El cáñamo prefiere un suelo suficientemente profundo y bien aireado con un pH de 6 o más, junto con una buena capacidad de retención de nutrientes y humedad. Sin embargo, no se recomiendan los suelos mal drenados, ya que el exceso de agua después de fuertes lluvias puede dañar el cultivo de cáñamo. El cáñamo es extremadamente sensible a las inundaciones y la compactación del suelo.
Preparación del suelo

Se requiere un semillero fino y firme para una germinación rápida y uniforme de la semilla de cáñamo. Probablemente lo ideal sea la preparación y la siembra convencionales del lecho de siembra. Las plántulas no emergerán de manera uniforme si la semilla se coloca a una profundidad mayor de 2 pulgadas. Los "sistemas de labranza cero" también se pueden usar con buenos resultados, pero pueden ser más vulnerables a una emergencia errática dependiendo de la temporada de crecimiento.
3. Nutrición

Para lograr un rendimiento óptimo de cáñamo, el cultivo debe disponer del doble de nutrientes de los que finalmente se eliminarán del suelo en el momento de la cosecha. Un campo de cáñamo produce una gran cantidad de material vegetativo en un período vegetativo corto. La absorción de nitrógeno es más intensa durante las primeras 6 a 8 semanas, mientras que el potasio y, en particular, el fósforo se necesitan más durante la floración y la formación de semillas. El cáñamo industrial requiere 105 a 130 lbs./acre (120 a 150 kg./ha) de nitrógeno, 45 a 70 lbs./acre (50 a 80 kg / ha) fosfato y 52 a 70 lbs./acre (60 a 80 kg) / ha) potasa.

El cáñamo prefiere un clima templado, una atmósfera húmeda y una lluvia de al menos 25-30 pulgadas por año. Se requiere una buena humedad del suelo para la germinación de las semillas y hasta que las plantas jóvenes estén bien establecidas.
5. Control de malezas

El cáñamo industrial es un supresor de malezas extremadamente eficaz. No se necesitan productos químicos para cultivar este cultivo. El cáñamo industrial es un cultivo de bajo mantenimiento. No hay productos químicos registrados para el control de malezas en el cáñamo. Una plantación normal de 200 a 300 plantas por metro cuadrado sombrea las malas hierbas, dejando los campos libres de malas hierbas en la cosecha para la próxima cosecha.

Observe el efecto de dosel creado por la densa plantación. Cuando se planta y cultiva correctamente, el control de malezas no es un problema.

Aunque el cáñamo está bien adaptado a la zona climática templada y crecerá en condiciones ambientales variadas, crece mejor con condiciones cálidas de crecimiento, una temporada prolongada sin heladas, suelos agrícolas altamente productivos y abundante humedad durante la temporada de crecimiento. Cuando se cultiva en condiciones adecuadas, el cáñamo es muy competitivo con las malas hierbas y, por lo general, no se requieren herbicidas en la producción de cáñamo. Aunque se han informado varias plagas y enfermedades de insectos en el cáñamo, no son comunes las pérdidas significativas de cultivos a causa de las plagas. Se requieren altos niveles de fertilidad del suelo para maximizar la productividad del cáñamo. Los requisitos culturales y los costos de producción son bastante similares a los del maíz. Los rendimientos de cáñamo reportados varían de 2.5 a 8.7 toneladas de tallos secos por acre.

Los requisitos climáticos y de suelo del cáñamo se pueden cumplir en algunas áreas agrícolas del PNW, sin embargo, es casi seguro que el cáñamo requerirá riego para maximizar de manera confiable la productividad en la región. El requisito de riego suplementario colocará al cáñamo en competencia directa con los cultivos de mayor valor en el PNW, lo que limitará la superficie disponible. Los rendimientos de los tallos tendrán que ser sustancialmente más altos que los registrados anteriormente para que el cáñamo sea económicamente viable en el PNW a los precios actuales. Es poco probable que la inversión necesaria para mejorar la tecnología de producción de cáñamo se realice hasta que se eliminen las restricciones legislativas del cultivo.


El cáñamo funciona bien en una variedad de tipos de suelo, pero no tolera la sequía, las inundaciones, los suelos saturados o salinos. Está
tolera las heladas primaverales ligeras. Las pruebas muestran que el cáñamo crece bien en los suelos de color marrón oscuro a negro espeso de
Saskatchewan con textura media, alta humedad del suelo y una larga temporada de crecimiento. Esto es particularmente cierto para
Finola, una variedad del norte de origen ruso / finlandés. El cáñamo no es adecuado para el suroeste debido a la
condiciones más secas y suelos arcillosos pesados. En general, el cáñamo se adapta mejor a áreas con lluvias moderadas y buenas
fertilidad del suelo.
La madurez varía de 80 a 120 días dependiendo de la variedad y fecha de siembra. El cáñamo es una planta fotosensible,
por lo tanto, la floración de la planta se desencadena por días más cortos después del 21 de junio. Cultivos sembrados a principios de primavera
puede producir tallos más altos y rendimientos más altos, pero no florecerá ni madurará mucho antes que los cultivos sembrados más tarde.
El cáñamo debe sembrarse entre el 1 y el 31 de mayo, siendo el 15 de mayo la fecha óptima para la siembra. Ya que
el cáñamo es sensible a la duración del día,
Los cultivos de siembra tardía no tendrán suficiente biomasa para producir un buen rendimiento, ya que la planta florecerá después del 21 de junio.
independientemente del tamaño de la planta


Condiciones del suelo:
iHemp responde a un suelo franco y bien drenado con pH (acidez) superior a 6.0. Se prefiere de neutro a ligeramente alcalino (pH 7,0 - 7,5). Cuanto mayor sea el contenido de arcilla del suelo, menor será el rendimiento de grano o fibra. Los suelos arcillosos se compactan fácilmente y iHemp es muy sensible a la compactación del suelo. Las plantas jóvenes son muy sensibles a suelos húmedos o inundaciones durante las primeras 3 semanas o hasta que el crecimiento alcanza el cuarto entrenudo (aproximadamente 30 cm o 12 ”de altura). Las plantas dañadas por el agua permanecerán atrofiadas, lo que dará como resultado una cosecha pobre, desigual y con malas hierbas.

Los suelos arenosos poco estructurados y propensos a la sequía proporcionan muy poca fertilidad natural o apoyo para la planta iHemp. Se necesitarán nutrientes y agua adicionales para lograr los máximos rendimientos en estos suelos, por lo que los costos adicionales hacen que la producción sea antieconómica.


Gen: tipos y funciones del gen

El término gen fue introducido por Johanssen en 1909. Antes de él, Mendel había usado la palabra factor para una unidad de herencia específica, distinta y particulada que participa en la expresión de un rasgo. Johanssen ha definido el gen como una unidad elemental de herencia que puede asignarse a un rasgo particular.

El trabajo de Morgan sugirió que el gen es el segmento más corto del cromosoma que puede separarse a través del cruzamiento, puede sufrir mutaciones e influir en la expresión de uno o más rasgos. Actualmente, un gen se define como una unidad de herencia compuesta por un segmento de ADN o cromosoma situado en un locus específico (locus del gen) que lleva información codificada asociada con una función específica y puede sufrir tanto cruzamiento como mutación.

(i) Una unidad de material genético que puede replicarse,

(ii) Es una unidad de recombinación, es decir, capaz de sufrir entrecruzamiento,

(iii) Una unidad de material genético que puede sufrir mutaciones,

(iv) Una unidad de herencia relacionada con la estructura o función somática que conduce a una expresión fenotípica. Lewin (2000) ha definido el gen como una secuencia de ADN que codifica un producto difusible.

A partir de su trabajo sobre auxótrofos de Neurospora, Beadle y Tatum (1948) propusieron la hipótesis de un gen y una enzima y definieron el gen como una unidad de material hereditario que especifica una sola enzima. Yanofsky et al (1965) observaron que ciertas enzimas podrían estar compuestas por más de un polipéptido.

Reemplazaron la hipótesis de un gen de una enzima con la hipótesis de un gen de un polipéptido (el gen es una unidad de material hereditario que especifica la síntesis de un único polipéptido). En ese momento había quedado claro que el material hereditario del cromosoma tímido es ADN y que un gen es un segmento lineal de ADN llamado cistrón.

Por tanto, el término cistrón se ha convertido en sinónimo de gen. Además, un gen o cistrón no solo puede sintetizar un polipéptido sino también ARN ribosómico o de transferencia. El cistrón (o gen) es un segmento de ADN que consta de un tramo de secuencias de bases que codifican un polipéptido, una molécula de ARN de transferencia (ARNt) o ARN ribosómico (ARNr). Actualmente, dicho gen se llama gen estructural.

El sistema genético también contiene una serie de genes reguladores que controlan el funcionamiento de los genes estructurales. Sin embargo, existen varias excepciones, por ejemplo, genes superpuestos, genes de poli-proteínas, genes divididos, etc.

Un gen o cistrón tiene muchas posiciones o sitios donde pueden ocurrir mutaciones. Un cambio en un solo nucleótido puede dar lugar a un fenotipo mutante, por ejemplo, anemia de células falciformes. De manera similar, dos cistrones defectuosos pueden recombinarse para formar un cistrón de tipo salvaje. A pesar de los cambios anteriores en los conceptos de características mutacionales estructurales y de recombinación del gen, el concepto funcional sigue siendo el mismo: es una unidad de herencia.

Tipos de genes:

1. Genes de mantenimiento de la casa (genes constitutivos):

Son aquellos genes que se expresan constantemente en una célula porque sus productos son necesarios para las actividades celulares normales, por ejemplo, genes para la glucólisis, ATP-ase

2. Genes no constitutivos (genes de lujo):

Los genes no siempre se expresan en una célula. Se activan o desactivan de acuerdo con los requisitos de las actividades celulares, por ejemplo, el gen de la nitrato reductasa en las plantas, el sistema de lactosa en Escherichia coli. Los genes no constitutivos son de otros dos tipos, inducibles y reprimibles.

Los genes se activan en respuesta a la presencia de una sustancia química o inductor que se requiere para el funcionamiento del producto de la actividad génica, por ejemplo, nitrato para nitrato reductasa.

Son aquellos genes que continúan expresándose hasta que una sustancia química (a menudo un producto final) inhibe o reprime su actividad. La inhibición por un producto final se conoce como represión por retroalimentación.

5. Multigenes (familia de múltiples genes):

Es un grupo de genes similares o casi similares para cumplir con los requisitos de tiempo y productos específicos de tejido, por ejemplo, la familia de genes de globina (e, 5, (3, у en el cromosoma 11, oc y 8 en el cromosoma 16).

Los genes se encuentran en múltiples copias porque sus productos se requieren en mayor cantidad, por ejemplo, genes de histonas, genes de tRNA, genes de rRNA, genes de actina.

Los genes están presentes en copias únicas (en ocasiones 2 a 3 veces), p. Ej., Genes que codifican proteínas. Forman del 60 al 70% de los genes funcionales. Las duplicaciones y timidez, las mutaciones y la reorganización de exones pueden formar nuevos genes.

Son genes que tienen homología con genes funcionales pero que son incapaces de producir productos funcionales debido a codones sin sentido intervinientes, inserciones, desestabilizaciones e inactivación de regiones promotoras, por ejemplo, varios genes de snRNA.

Son genes eucariotas que carecen de intrones. Los genes procesados ​​se han formado probablemente debido a la transcripción inversa o retrovirus. Los genes procesados ​​generalmente no son funcionales ya que carecen de promotores.

Fueron descubiertos en 1977 por muchos trabajadores, pero se le da crédito a Sharp y Roberts (1977). Los genes divididos son aquellos genes que poseen regiones extra o no esenciales intercaladas con partes esenciales o codificantes. Las partes no esenciales se denominan intrones, ADN espaciador o secuencias intermedias (IVS). Las partes esenciales o codificantes se denominan exones. Las regiones intrónicas transcritas se eliminan antes de que el ARN pase al citoplasma. Los genes divididos son característicos de los eucariotas.

Sin embargo, ciertos genes eucariotas son completamente exónicos o no se dividen, por ejemplo, genes de histonas, genes de interferón. También se han registrado genes divididos en procariotas, gen de timidilato sintasa y gen de ribonucleótido reductasa en T4. Un gen que produce calcitonina en la tiroides forma un neuropéptido en el hipotálamo al eliminar un exón. El adenovirus también tiene un mecanismo para producir de 15 a 20 proteínas diferentes a partir de una única unidad transcripcional mediante empalme diferencial.

11. Transposones (Jumping Genes Hedges y Jacob, 1974):

Son segmentos de ADN que pueden saltar o moverse de un lugar del genoma a otro. Los transposones fueron descubiertos por primera vez por Me Clintock (1951) en el caso del maíz cuando descubrió que un segmento de ADN se movía hacia el gen que codifica los granos pigmentados y producía granos de colores claros.

Los transposones poseen ADN repetitivo, similar o invertido, en sus extremos, de unos 5, 7 o 9 nucleótidos de longitud. La enzima transposasa separa el segmento de su original escindiendo las secuencias repetitivas en sus extremos.

Hay muchos tipos de transposones. En los seres humanos, los tipos más comunes de transposones pertenecen a la familia Alu (que tiene un sitio de corte por la enzima de restricción Alu I). El número de nucleótidos por transposón es de unos 300 con unas 300.000 copias en el genoma. El paso de transposones de un lugar a otro provoca la reorganización de las secuencias de nucleótidos en los genes. La reorganización de intrones a menudo cambia la expresión de genes, por ejemplo, protooncogenes → oncogenes. Es posible que se desarrollen nuevos genes mediante la mezcla de exones. Otros cambios provocados por los transposones son las mutaciones, a través de inserciones, deleciones y translocaciones.

En ф x 174, los genes В E y К se superponen con otros genes.

Los genes estructurales son aquellos genes que han codificado información para la síntesis de sustancias químicas necesarias para la maquinaria celular.

Las sustancias químicas pueden ser:

(a) Polipéptidos para la formación de proteínas estructurales (por ejemplo, complejo coloidal de protoplasma, membranas celulares, elastina de ligamentos, colágeno de tendones o cartílago, actina de músculos, tubulina de microtúbulos, etc.). (b) polipéptidos para la síntesis de enzimas,

(c) Proteínas transportadoras como la hemoglobina de los eritrocitos, las pro y timiteínas transportadoras de lípidos, las proteínas transportadoras de las membranas celulares, etc.

(d) Hormonas proteicas, por ejemplo, insulina, hormona del crecimiento, hormona paratiroidea,

(e) Anticuerpos, antígenos, ciertas toxinas, factores de coagulación y timilación sanguínea, etc.

(f) ARN no traducidos como ARNt, ARNr. En términos generales, los genes estructurales producen ARNm para la síntesis de polipéptidos / proteínas / enzimas o ARN no codificantes.

14. Genes reguladores (secuencias reguladoras):

Los genes reguladores no transcriben ARN para controlar la estructura y el funcionamiento de las células. En cambio, controlan las funciones de los genes estructurales. Los genes reguladores importantes son promotores, terminadores, operadores y genes reguladores o productores de represores. El represor no participa en la actividad celular. En cambio, regula la actividad de otros genes. Por tanto, el gen productor de represor es de naturaleza intermedia.

15. Genes específicos de tejido:

Son genes que se expresan solo en determinados tejidos específicos y no en otros.

Funciones genéticas:

(i) Los genes son componentes del material genético y, por lo tanto, son unidades de herencia,

(ii) Controlan la morfología o el fenotipo de los individuos,

(iii) La replicación de genes es esencial para la división celular,

(iv) Los genes llevan la información hereditaria de una generación a la siguiente,

(v) Controlan la estructura y el metabolismo del cuerpo,

(vi) La reorganización de genes en el momento de la reproducción sexual produce variaciones,

(vii) Se producen diferentes encadenamientos debido al cruzamiento,

(viii) Los genes sufren mutaciones y cambian su expresión,

(ix) Se desarrollan nuevos genes y, en consecuencia, nuevos rasgos debido a la reorganización de exones e intrones.

(x) Los genes cambian su expresión debido al efecto de posición y los transposones.

(xi) La diferenciación o formación de diferentes tipos de células, tejidos y órganos en diversas partes del cuerpo está controlada por la expresión de ciertos genes y la no expresión de otros.

(xii) Los genes controlan el desarrollo o la producción de diferentes etapas de la historia de la vida.


Lecciones de las bacterias

Como estudiante de posgrado, Sternberg trabajó con Doudna para desarrollar una de las primeras herramientas basadas en CRISPR. Desde que se unió a Columbia en 2018, Sternberg ha ampliado su búsqueda, buscando sistemas de edición de genes adicionales que se encuentran en las formas de vida más tempranas de la naturaleza y detallando cómo se pueden implementar para avanzar en el descubrimiento genómico en el laboratorio. “Las bacterias han estado luchando contra los virus durante mucho tiempo y la diversificación de su sistema inmunológico es un tesoro para construir nuevas tecnologías”, dice. "No hemos terminado de descubrir nueva biología, y cuanto más encontramos, más podemos aprovechar para el desarrollo de herramientas".

El trabajo surge de las formas de vida predominantemente unicelulares conocidas como procariotas, los organismos que carecen de un núcleo u otros orgánulos dedicados. Con el ADN flotando libremente por todo su citoplasma, los procariotas no pueden permitirse el lujo de descuidar la detección y neutralización de genes extraños que podrían resultar en su perdición. Ingrese a la herramienta de vigilancia del ADN innato que sirve como un sistema inmunológico adaptativo proteico. Cada vez que una bacteria vence al ADN patógeno, captura algunos fragmentos característicos —esas repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente y espaciadas— y crea una copia de ARN, el equivalente genético de un póster buscado. A medida que el sistema inmunológico adaptativo de la bacteria continúa vigilando el citoplasma procariótico, examina esos haces de carteles de se busca. En el caso de una identificación positiva, utiliza una proteína asociada a CRISPR (Cas, para abreviar) como un bisturí de precisión para montar una defensa enérgica y robusta, cortando el ADN ofensivo en pedazos y deteniendo al invasor en seco.

CRISPR ha transformado por completo la forma en que los biólogos estudian biología. Ha brindado a los científicos básicos una forma nueva y más poderosa de hacer preguntas como, "¿Qué genes están involucrados en que el cáncer se convierta en metastásico?" Y abrió nuevas vías para el desarrollo de fármacos.

Los eucariotas, desde los hongos hasta los humanos, cuentan con un núcleo para contener y proteger el ADN, lo que hace que la modificación de genes específicos sea una empresa que requiere mucho tiempo y es técnicamente desafiante.Utilizando una combinación de productos químicos, corriente eléctrica, virus y micropipetas, los técnicos atraviesan la membrana celular y penetran en el núcleo celular para inducir roturas en el ADN, todo sin matar la célula. Luego, confían en la reparación homóloga, un sistema de control de calidad innato que las células utilizan para reparar hebras de ADN rotas. (Es muy parecido a remendar un par de jeans: si el parche y el agujero se corresponden alrededor de los bordes, el empalme se mantendrá).

Las innovaciones tecnológicas de las últimas décadas (secuenciación de genes, clonación de células, interferencia de ARN, tecnología de nucleasa de dedos de zinc y nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción, por ejemplo) les han dado a los científicos un mayor control de sus manipulaciones, permitiéndoles activar o desactivar genes diana para crear animales "knock-in" o "knockout". CRISPR, sin embargo, ha sido transformador, permitiendo a los científicos cortar y pegar hebras de ADN en lugares específicos, todo dentro del núcleo de células vivas. Primero, crean un ARN CRISPR sembrado con fragmentos de una secuencia genética objetivo. Luego lo inyectan, junto con una enzima Cas, en el núcleo de un eucariota. Cas se concentra en la ubicación especificada por el ARN e induce roturas de doble hebra.

“Los sistemas inmunológicos CRISPR-Cas han transformado completamente las formas en que los biólogos estudian la biología”, dice Sternberg. “Le ha dado a los científicos básicos una forma nueva y más poderosa de hacer preguntas como, '¿Qué genes están involucrados en el cáncer que se convierte en metastásico?' Y abrió nuevas vías para el desarrollo de fármacos. En todo el campus, la gente está utilizando CRISPR como una mejor manera de diseñar sus experimentos ".


Los elementos de barrera protegen contra la represión a largo plazo

El ensayo de efecto de posición (descrito anteriormente) se ha utilizado ampliamente para identificar aislantes de vertebrados con actividad de barrera (por ejemplo, ver Pikaart et al. 1998). Los transgenes generados en sistemas de vertebrados a menudo se ven afectados por las dos formas antes mencionadas de efectos de posición cromosómica. La influencia de los reguladores transcripcionales colocados en el sitio de inserción del transgén conduce a diferencias en el patrón de expresión entre líneas generadas independientemente. Es importante señalar que inicialmente todas las células de una línea individual expresan el transgén al mismo nivel. En ensayos a largo plazo, la mayoría de los transgenes también quedan sujetos a silenciamiento epigenético por cromatina condensada. Esta forma de efecto de posición no es uniforme: en un momento dado, las células genéticamente idénticas mostrarán diferentes fenotipos, lo que refleja el grado variable en el que la cromatina condensada adyacente ha invadido el transgén. En este sentido, el silenciamiento a largo plazo es muy similar a la variación del efecto de posición observado enDrosophila y levadura. La variedad en células de vertebrados es diferente en un aspecto importante: no hay reactivación espontánea de transgenes ya silenciados. Sin embargo, no es probable que esta diferencia provenga de procesos divergentes de silenciamiento, pero lo más probable es que se pueda explicar por el hecho de que los estados silenciados en los sistemas de vertebrados se fijan mediante la metilación de CpG, un mecanismo no utilizado por Drosophila o levadura.

Se ha demostrado que un número creciente de elementos protegen contra los efectos de posición en las células de mamíferos, muchos de los cuales se resumen en la Tabla 1. El elemento aislante HS4 del límite corriente arriba del pollo β-globina el locus es el mejor caracterizado de estos elementos. Las construcciones de transgenes flanqueantes con copias del aislante HS4 han demostrado ser útiles en la generación de muchos ratones transgénicos (Wang et al. 1997 Potts et al. 2000 Boeda et al. 2001 Ciana et al. 2001), conejo (Taboit-Dameron et al. 1999) y líneas celulares (Pikaart et al. 1998 Inoue et al. 1999 Emery et al. 2000 Rivella et al. 2000 Steinwaerder y Lieber 2000) con expresión transgénica uniforme en todos los tipos de tejidos. HS4 se encuentra en el límite entre la cromatina abierta del dominio del gen de la globina activa y una región aguas arriba de la cromatina condensada en las células eritroides (Prioleau et al. 1999). Se ha propuesto que la capacidad de HS4 para proteger contra el silenciamiento cromosómico en ensayos transgénicos refleja un papel en su ubicación endógena en la prevención de la incursión de las actividades represivas de la cromatina aguas arriba en el globina locus (Prioleau et al. 1999).

Vale la pena señalar que el posicionamiento de los elementos HS4 es fundamental para el diseño exitoso de vectores transgénicos. Al igual que la actividad de bloqueo del potenciador, la actividad de barrera de HS4 depende de la posición: debe colocarse entre la fuente anticipada de silenciamiento y los elementos transgénicos a proteger. Por ejemplo, estudios recientes en los que se utilizó HS4 para proteger transgenes en vectores retrovirales subrayan la necesidad de colocar aislantes flanqueando los elementos transgénicos insertados para que puedan protegerse tanto de los silenciadores retrovirales como del efecto de posición cromosómica (Pannell y Ellis 2001). Los LCR son combinaciones naturales dominantes de varios potenciadores específicos de tejido potentes que también son capaces de superar la mayoría de los efectos de posición. Observamos que aunque los LCR pueden ser útiles para superar la supresión de la expresión transgénica, su estricta especificidad de tejido y susceptibilidad a los silenciadores retrovirales los hace menos útiles para el blindaje de transgenes (Q. Li et al. 1999 Ellis y Pannell 2001 Pannell y Ellis 2001 ). Además, la falta de mejora transcripcional por los propios elementos aislantes puede facilitar la caracterización de otros elementos transcripcionales dentro de un contexto de cromatina (por ejemplo, Boeda et al. 2001 Ciana et al. 2001).

Elementos barrera en la levadura

Los elementos de barrera mejor caracterizados se encuentran en los loci de tipo de apareamiento silencioso y las regiones subteloméricas en la levadura en ciernes.Saccharomyces cerevisiae (para una revisión, ver Bi y Broach 2001). La levadura de gemación haploide lleva copias transcripcionalmente silenciosas del tipo de apareamiento específico. ESTERA a y ESTERAgenes α en el HMR y HML loci, respectivamente (Figura 4A para revisión, ver Haber 1998). En los dos silenciosos HM loci, los genes de tipo apareamiento están flanqueados por elementos silenciadores denominados mi y I que reclutan el complejo proteico Sir 2/3/4 responsable de la represión. La actividad silenciadora resultante se limita a la HM loci por elementos de barrera que flanquean el mi y I silenciadores. Movimiento o supresión de las barreras que flanquean HMR conduce a la expansión del dominio silencioso (Donze et al. 1999). La barrera telomérica-proximal de HMR ha sido mapeado a un tRNA Thr gen (Donze y Kamakaka 2001). Se descubrió que la actividad de esta barrera requiere el potencial transcripcional de este gen, como lo revela la mutagénesis que interrumpe la formación de un complejo de preiniciación.

(A) Los loci de tipo apareamiento en el cromosoma III de Saccharomyces cerevisiae. El silencioso α- ya-los genes de apareamiento de tipo se encuentran en el HML (verde) yHMR (rojo) loci, respectivamente. Las copias activas de cualquier tipo se encuentran en la ESTERA locus (rojo o verde). Silenciando enHML y HMR está establecido por el mi yI silenciadores que flanquean cada lugar (triángulos azules). Los límites aguas abajo del silenciamiento en HML y HMRhan sido mapeados a elementos de barrera en el CHA1 ytRNA Thr genes, respectivamente (naranja, ver texto). (B) Los loci de tipo apareamiento en el cromosoma II deSchizosaccharomyces pombe. El silencio PAG- yMETRO-tipo de genes de apareamiento se encuentran en mat2 (verde) ymat3 (rojo) loci, respectivamente. La copia activa de cualquier tipo se encuentra en la mat1 locus (verde o rojo). los mat2y mat3 los loci son silenciados por el establecimiento de heterocromatina en cenH (azul) y silenciadores adicionales (triángulos azules). La extensión de la heterocromatina se ha mapeado en secuencias repetidas invertidas que flanquean la mat2 / 3 loci (flechas negras, ver texto). (C) Un modelo para la actividad barrera de los aisladores (ver texto). Un diagrama esquemático basado en el ejemplo del límite corriente arriba del pollo. β-globina lugar. Las proteínas aislantes reclutan constitutivamente histonas acetiltransferasas que acetilan los nucleosomas flanqueantes (esferas rojas). La acetilación sirve para inhibir las modificaciones de histonas necesarias para la propagación de cromatina condensada transcripcionalmente silenciosa (esferas azules empaquetadas). HP1 / SUV39H1 se muestra como parte de la propagación de complejos de proteínas represivas asociadas con la histona H3 metilada en Lys 9. Los complejos de proteínas Sir asociadas con la cromatina desacetilada pueden ser funcionalmente análogos en la levadura en gemación. Las barreras actúan para terminar la cadena de cromatina represiva compitiendo en el proceso de modificación de histonas.

Observaciones en el HML-I silenciador han llevado a la sugerencia de que los límites del silencio HM El dominio del locus puede estar determinado por la polaridad de los propios silenciadores (Bi et al. 1999). Sin embargo, se ha demostrado recientemente que las proteínas silenciadoras asociadas con el dominio silencioso se extienden más allá de los silenciadores en ambosHML y HMR (Fig. 4A Lieb et al. 2001). Las proteínas silenciadoras no se extienden más allá del HMR elementos de barrera descritos anteriormente. Estos estudios apuntan colectivamente a una transición escalonada en las estructuras de cromatina en los límites de la S. cerevisiae HM lugar. Los elementos silenciadores que son de naturaleza esencialmente polar reclutan complejos de proteínas silenciadoras que se extienden hacia adentro para establecer un dominio silencioso rígido. Se requieren elementos de barrera de heterocromatina ubicados a ambos lados de los loci de tipo apareamiento para bloquear la propagación adicional de proteínas silenciadoras que se escapan del locus silencioso. Vale la pena señalar que a pesar de la presencia de proteínas silenciadoras en la cromatina entre los HMR-E silenciador y la barrera, actividad de un URA3 El gen reportero no se ve tan afectado por el silenciamiento como si se coloca entre los HMR-E yHMR-I silenciadores (Donze et al. 1999). Esto sugiere que las proteínas silenciadoras filtradas son insuficientes para la actividad silenciadora completa.

Las observaciones en el S. cerevisiae HM locus son algo comparables con los de los loci silenciosos de tipo apareamiento deSchizosaccharomyces pombe. La levadura de fisión haploide lleva copias transcripcionalmente silenciosas del tipo de apareamiento específico. METRO(menos) y PAG (más) genes en el mat2 ymat3 loci, respectivamente (Fig. 4B para revisión, ver Grewal 2000). Varios cis elementos en el mat2 / 3 los loci sirven para reclutar trans-actuando complejos de proteínas heterocromáticas que son responsables de la represión. Se ha propuesto que el límite corriente arriba del silencio mat2 / 3 locus se establece por la aparente polaridad de la REII silenciador. Supresión deREII conduce a un silenciamiento insuficiente del mat2 / 3locus, mientras que la inversión de REII conduce a la expansión del dominio silencioso (Ayoub et al. 2000). Sin embargo, desde entonces se ha encontrado que las proteínas y las modificaciones de histonas asociadas con el silenciamiento se extienden más allá del REII silenciador (Noma et al. 2001). El dominio silencioso de 20 kb se caracteriza particularmente por la presencia delDrosophila Swi6 homólogo de HP1 e histona H3 metilada en Lys 9 (Noma et al. 2001, y referencias allí). La extensión de la heterocromatina se ha mapeado en secuencias repetidas invertidas que flanquean la mat2 / 3 loci. La eliminación de cualquiera de las secuencias repetidas conduce a la propagación de la metilación de H3 Lys 9 y Swi6 en secuencias vecinas, lo que sugiere que las repeticiones invertidas actúan como barreras que definen la extensión del dominio heterocromático (Noma et al. 2001).

También se han identificado barreras a la propagación de la cromatina represiva dentro del mosaico de elementos repetidos asociados con los telómeros de la levadura en ciernes. Estudios recientes han encontrado que el silenciamiento que se propaga desde los extremos cromosómicos es discontinuo (Pryde y Louis 1999). La inserción de un gen informador en diferentes ubicaciones a lo largo de los extremos del cromosoma nativo revela que el silenciamiento es máximo en el elemento central de la repetición X. Telómero-proximal a esta repetición, a menudo hay varios genes transcritos activamente del RTM ySUC familias, además de copias de la repetición Y 'que albergan poca actividad represiva (para una revisión, ver Pryde et al. 1997). Investigaciones posteriores revelaron elementos de barrera denominados ESTRELLA, ubicado entre las repeticiones X e Y ', que restringen el silenciamiento telomérico a áreas limitadas (Fourel et al. 1999). Estas ESTRELLALos elementos consisten en múltiples sitios de unión para las proteínas Tbf1 y Reb1. Se ha demostrado que los dominios de activación de Tbf1 y Reb1 son suficientes para proporcionar actividad de barrera cuando se unen mediante un dominio de unión al ADN de GAL4 (Fourel et al. 2001). De hecho, también se encontró que la unión de dominios de activación ácidos o ricos en prolina (pero no ricos en glutamina) de varios factores de transcripción de mamíferos era suficiente para recapitular la actividad de barrera sin activar directamente la transcripción de genes indicadores.

De estos estudios se desprende claramente que las barreras actúan como terminadores de cadena que interrumpen la polimerización de complejos silenciadores, como el complejo Sir2 / 3/4 en la levadura en gemación y Swi6 en la levadura de fisión. Se ha postulado que esto se puede lograr simplemente interrumpiendo la matriz de nucleosomas requerida como plantilla para la propagación de complejos silenciadores (Bi y Broach 1999). Esto puede ocurrir de forma pasiva por la formación de complejos de proteínas no histonas estables que actuarían como barreras físicas. Sin embargo, la interrupción de una matriz nucleosómica después de la unión del dominio de unión al ADN de GAL4 a un GAL4 UAS o Cha4p no inducido a un CHA1 El UAS no es suficiente para la actividad de barrera (Donze y Kamakaka 2001 Fourel et al. 2001). Esto sugiere que las barreras alteran activamente la estructura de la cromatina vecina de una manera refractaria a la propagación del silenciamiento. De acuerdo con este punto de vista, la actividad del HMR Se descubrió que el ARNt Thr es sensible a la alteración de los genes que codifican las histonas acetiltransferasas Sas2 y Gcn5 (HAT). Además, la unión de estas enzimas modificadoras fue suficiente para recapitular la actividad de barrera (Donze y Kamakaka 2001).

Aunque esta discusión se limita por completo a la levadura, se ha encontrado un patrón sorprendente de regiones de cromatina activa e inactiva intercaladas dentro del cuarto Drosophila cromosoma (Sun et al. 2000). Es de suponer que también aquí los elementos de barrera deben desempeñar un papel importante.

Modificaciones de histonas y actividad de barrera de heterocromatina

Las observaciones de que las barreras para la propagación del silenciamiento en la levadura en ciernes pueden actuar para atar los HAT se reflejan en las observaciones en el pollo. β-globina lugar. Los nucleosomas que flanquean el elemento aislante HS4 se acetilan en las histonas H3 y H4 en todos los tejidos estudiados, y se ha postulado que estas modificaciones son responsables de su capacidad para proteger contra CPE (Litt et al. 2001a). Para explicar el fenómeno de la variación del efecto de posición enDrosophila, se ha propuesto que los complejos de proteínas heterocromáticas se extienden sobre la cromatina de forma lineal (Tartof et al. 1984). Hallazgos recientes apoyan un modelo escalonado en el que la proteína HP1 asociada a heterocromatina interactúa específicamente con la histona H3 solo cuando Lys 9 se ha metilado (Bannister et al. 2001 Lachner et al. 2001 Nakayama et al. 2001). HP1 interactúa con la histona metiltransferasa (HMT) SUV39H1, que, a su vez, puede metilar H3 en Lys 9, proporcionando así un nuevo sitio de unión para que HP1 propague la estructura represiva (Rea et al. 2000). La región de cromatina condensada y presuntamente represiva aguas arriba del pollo.β-globina Se ha descubierto recientemente que el locus está altamente enriquecido en H3 metilado en Lys 9 (Litt et al. 2001b). Se ha propuesto que una función del elemento HS4 es proteger el β-globina locus de esta cromatina represiva proporcionando un centro de acetilación de histonas para actuar como un terminador de cadena del silenciamiento heterocromático (Fig. 2 Litt et al. 2001a, b).

Recientemente se ha demostrado que el componente Sir2 del complejo silenciador de levadura en ciernes posee una actividad histona desacetilasa dependiente de NAD (N-HDAC para revisión, ver Moazed 2001). Los complejos de proteínas Sir se propagan desde los sitios de nucleación para silenciar una gran región de cromatina característicamente hipoacetilada (Grunstein 1998 Suka et al. 2001). Los mutantes Sir2 que carecen de actividad N-HDAC anulan tanto el rDNA como el silenciamiento telomérico (Perrod et al. 2001). Estos hallazgos apoyan un modelo de trabajo en el que se requiere la desacetilación de histonas por Sir2 para propagar la propagación de los complejos silenciadores de Sir. Barreras de heterocromatina como HMR Es probable que el tRNA Thr bloquee el silenciamiento mediado por Sir proporcionando un centro de acetilación de histonas que actuaría como un terminador de cadena de una manera similar al aislante HS4 (Donze y Kamakaka 2001). Por tanto, aunque los complejos silenciadores y las modificaciones de histonas que utilizan para su propagación difieren, los elementos de barrera pueden tener un mecanismo común de terminación de la cadena por competición por modificaciones de histonas.


Modificaciones de histonas

La arquitectura de la cromatina, el posicionamiento nucleosómico y, en última instancia, el acceso al ADN para la transcripción de genes, está controlado en gran medida por proteínas histonas. Cada nucleosoma está formado por dos subunidades idénticas, cada una de las cuales contiene cuatro histonas: H2A, H2B, H3 y H4. Mientras tanto, la proteína H1 actúa como histona enlazadora para estabilizar el ADN internucleosómico y no forma parte del nucleosoma en sí.

Las proteínas histonas se someten a modificaciones postraduccionales (PTM) de diferentes formas, lo que afecta sus interacciones con el ADN. Algunas modificaciones interrumpen las interacciones entre las histonas y el ADN, lo que hace que los nucleosomas se desenrollen. En esta conformación de cromatina abierta, llamada eucromatina, el ADN es accesible para la unión de la maquinaria transcripcional y la posterior activación de genes. Por el contrario, las modificaciones que fortalecen las interacciones histona-ADN crean una estructura de cromatina muy compacta llamada heterocromatina. En esta forma compacta, la maquinaria transcripcional no puede acceder al ADN, lo que resulta en el silenciamiento del gen. De esta manera, la modificación de histonas por complejos remodeladores de cromatina cambia la arquitectura de la cromatina y la activación de genes.

Figura 1: Las modificaciones de histonas más comunes. Para obtener más información, consulte nuestro cartel de modificaciones de histonas

Juntas, estas modificaciones de histonas forman lo que se conoce como el código de histonas, que dicta el estado transcripcional de la región genómica local. El examen de las modificaciones de las histonas en una región particular, o en todo el genoma, puede revelar estados de activación de genes, ubicaciones de promotores, potenciadores y otros elementos reguladores de genes.

Modificaciones de histonas en detalle

Acetilación

La acetilación es una de las modificaciones de histonas más estudiadas, ya que fue una de las primeras que se descubrió que influye en la regulación transcripcional. La acetilación agrega una carga negativa a los residuos de lisina en las colas de histonas N-terminales que se extienden desde el nucleosoma. Estas cargas negativas repelen el ADN cargado negativamente, lo que da como resultado una estructura de cromatina relajada.La conformación de cromatina abierta permite la unión del factor de transcripción y aumenta significativamente la expresión génica (Roth et al., 2001)

La acetilación de histonas participa en la regulación del ciclo celular, la proliferación celular y la apoptosis y puede desempeñar un papel vital en la regulación de muchos otros procesos celulares, incluida la diferenciación celular, la replicación y reparación del ADN, la importación nuclear y la represión neuronal. Un desequilibrio en el equilibrio de la acetilación de histonas está asociado con la tumorigénesis y la progresión del cáncer.

Los grupos acetilo se añaden a los residuos de lisina de las histonas H3 y H4 mediante histonas acetiltransferasas (HAT) y se eliminan mediante desacetilasas (HDAC). La acetilación de histonas se dirige en gran medida a las regiones promotoras, lo que se conoce como acetilación localizada por el promotor. Por ejemplo, la acetilación de K9 y K27 en la histona H3 (H3K9ac y H3K27ac) generalmente se asocia con potenciadores y promotores de genes activos. También se encuentran niveles bajos de acetilación global en todos los genes transcritos, cuya función sigue sin estar clara.

Metilación

La metilación se agrega a los residuos de lisina o arginina de las histonas H3 y H4, con diferentes impactos en la transcripción. La metilación de arginina promueve la activación transcripcional (Greer et al., 2012) mientras que la metilación de lisina está implicada tanto en la activación como en la represión de la transcripción, dependiendo del sitio de metilación. Esta flexibilidad puede explicarse por el hecho de que la metilación no altera la carga de las histonas ni impacta directamente en las interacciones entre las histonas y el ADN, a diferencia de la acetilación.

Las lisinas pueden ser mono, di o trimetiladas, lo que proporciona una diversidad funcional adicional a cada sitio de metilación. Por ejemplo, tanto la mono como la tri-metilación en K4 de la histona H3 (H3K4me1 y H3K4me3) son marcadores de activación, pero con matices únicos: H3K4me1 típicamente marca potenciadores transcripcionales, mientras que H3K4me3 marca promotores genéticos. Mientras tanto, la tri-metilación de K36 (H3K36me3) es un marcador de activación asociado con regiones transcritas en cuerpos génicos.

Por el contrario, la tri-metilación en K9 y K27 de la histona H3 (H3K9me3 y H3K27me3) son señales represivas con funciones únicas: H3K27me3 es una señal temporal en las regiones promotoras que controla los reguladores del desarrollo en las células madre embrionarias, incluidos los genes Hox y Sox. Mientras tanto, H3K9me3 es una señal permanente para la formación de heterocromatina en regiones cromosómicas pobres en genes con estructuras repetidas en tándem, como repeticiones satélite, telómeros y pericentrómeros. También marca los retrotransposones y familias específicas de genes de dedos de zinc (KRAB-ZFP). Ambas marcas se encuentran en el cromosoma X inactivo, con H3K27me3 en regiones codificantes intergénicas y silenciadas y H3K9me3 predominantemente en regiones codificantes de genes activos.

La metilación de histonas es una marca estable que se propaga a través de múltiples divisiones celulares y durante muchos años se pensó que era irreversible. Sin embargo, recientemente se descubrió que es un proceso regulado activamente y reversible.

Metilación: histonas metiltransferasas (HMT)

  • Lisina
    • SET que contiene dominios (colas de histonas)
    • Que no contiene dominio SET (núcleos de histonas)
    • Familia PRMT (proteína arginina metiltransferasas)

    Desmetilación: histonas desmetilasas

    • Lisina
      • KDM1 / LSD1 (desmetilasa 1 específica de lisina)
      • JmjC (que contiene el dominio Jumonji)
      • PAD4 / PADI4

      Fosforilación

      La fosforilación de histonas es un paso intermedio crítico en la condensación cromosómica durante la división celular, la regulación transcripcional y la reparación del daño del ADN (Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al., 2015). A diferencia de la acetilación y metilación, la fosforilación de histonas establece interacciones entre otras modificaciones de histonas y sirve como plataforma para las proteínas efectoras, lo que conduce a una cascada de eventos aguas abajo.

      La fosforilación ocurre en todas las histonas centrales, con efectos diferenciales en cada una. La fosforilación de la histona H3 en las serinas 10 y 28 y la histona H2A en T120 están implicadas en la compactación de la cromatina y en la regulación de la estructura y función de la cromatina durante la mitosis. Estos son marcadores importantes del ciclo celular y el crecimiento celular que se conservan en todos los eucariotas. La fosforilación de H2AX en S139 (que da como resultado γH2AX) sirve como punto de reclutamiento para las proteínas de reparación del daño del ADN (Lowndes et al., 2005, Pinto et al., 2010) y es uno de los primeros eventos que ocurren después de las roturas de la doble cadena del ADN. . La fosforilación de H2B no es un buen estudio, pero se encuentra que facilita la condensación de cromatina relacionada con la apoptosis, la fragmentación del ADN y la muerte celular (Füllgrabe et al., 2010).

      Ubicuidad

      Todas las proteínas del núcleo de las histonas pueden ubiquitilarse, pero H2A y H2B son las más comunes y son dos de las proteínas más ubiquitiladas en el núcleo (Cao et al., 2012). La ubiquitilación de histonas juega un papel central en la respuesta al daño del ADN.

      La monoubiquitilación de las histonas H2A, H2B y H2AX se encuentra en sitios de roturas de doble cadena de ADN. Las formas más comunes son H2A monoubiquitylated en K119 y H2B en K123 (levadura) / K120 (vertebrados). El H2A monoubiquitilado también se asocia con el silenciamiento de genes, mientras que el H2B también se asocia con la activación de la transcripción.

      La poliubiquitilación es menos común, pero también es importante en la reparación del ADN: la poliubiquitilación de H2A y H2AX en K63 proporciona un sitio de reconocimiento para las proteínas de reparación del ADN, como RAP80.

      Regulación enzimática

      Al igual que otras modificaciones de histonas, la monoubiquitilación de H2A y H2B es reversible y está estrechamente regulada por las histonas ubiquitina ligasas y enzimas desubiquitilantes.

      Monoubiquitylation

      Poliubiquitilación

      Guía de referencia rápida para modificaciones de histonas

      Modificaciones de histonas más comunes y dónde encontrarlas:

      Ubicación de la función de modificación de histonas

      Potenciadores de activación H3K4me1

      Promotores de activación H3K4me3

      Cuerpos génicos de activación H3K36me3

      Cuerpos génicos de activación H3K79me2

      Potenciadores de activación de H3K9Ac, promotores

      Potenciadores de activación de H3K27Ac, ​​promotores

      Secuencias repetitivas de activación de H4K16Ac

      Promotores de la represión H3K27me3, regiones ricas en genes

      H3K9me3 Repetición del satélite de represión, telómeros, pericentrómeros

      Daño del ADN de Gamma H2A.X Roturas de la doble hebra del ADN

      Replicación del ADN H3S10P Cromosomas mitóticos

      Estudio de modificaciones de histonas por ChIP

      ChIP usa anticuerpos para aislar una proteína o modificación de interés, junto con el ADN al que está unido (figura 5). Luego, el ADN se secuencia y se asigna al genoma para identificar la ubicación y abundancia de la proteína o modificación.

      Figura 2: ChIP de modificación de histonas. Los anticuerpos se unen directamente a las colas de histonas modificadas. La inmunoprecipitación y la purificación del ADN permiten el aislamiento y la identificación de las regiones genómicas que ocupan las modificaciones.

      El uso de anticuerpos contra histonas específicas y modificaciones de histonas en experimentos de ChIP puede revelar las ubicaciones específicas de

      • Estructuras de cromatina de orden superior, por ejemplo, H3K9me3 marca heterocromatina y repeticiones de satélite
      • Genes y programas genéticos activos o silenciados, por ejemplo, AH3K9ac marca la activación de genes
      • Elementos genéticos como promotores y potenciadores, por ejemplo, H3K27me3 marca a los promotores en regiones ricas en genes, H3K4me1 marca potenciadores activos

      Si se conoce la función de una modificación de histona, ChIP puede identificar genes y regiones específicos con esta firma de modificación de histona y la función correspondiente en todo el genoma. Estos genes y regiones pueden luego examinarse más a fondo para determinar su papel en el proceso biológico de interés. El uso de ChIP contra H3K4me1, por ejemplo, revelará las ubicaciones y secuencias de potenciadores activos en todo el genoma, apuntando a genes y programas genéticos de interés.

      Alternativamente, si no se conoce la función de la modificación de la histona, ChIP puede identificar secuencias, genes y ubicaciones con esta firma, que luego pueden usarse para inferir la función de la modificación. Esta técnica fue fundamental para decodificar gran parte del código de las histonas y sigue siendo valiosa para determinar la función de modificaciones recién descubiertas como la ubiquitilación y otras marcas novedosas.

      Enzimas modificadoras de histonas: escritores y borradores​

      Las modificaciones de histonas se agregan y eliminan dinámicamente de las proteínas de histonas mediante enzimas específicas (tabla 1). El equilibrio entre estos escritores y borradores dicta qué marcas están presentes en las histonas y a qué niveles, para controlar en última instancia si los programas genéticos específicos y los procesos celulares que orquestan están activados o desactivados.

      Tabla 1. Las principales categorías de escritores y borradores de histonas.

      Modificación

      Histonas acetiltransferasas (HAT)

      Histonas desacetilasas (HDAC)

      Histonas metiltransferasas (HMT / KMT) y proteínas arginina metiltransferasas (PRMT)

      Para obtener más detalles sobre los lectores, escritores y borradores de modificaciones de histonas, consulte nuestro cartel de modificación epigenética.

      La identificación de las vías de modificación y los escritores y borradores específicos en juego puede revelar:

      • Vías celulares relevantes, programas genéticos y efectos fisiológicos para mayor investigación. Por ejemplo, las histonas desacetilasas (HDAC) activan las vías del desarrollo inmunológico, mientras que las histonas acetiltransferasas (HAT) desempeñan un papel crucial en la diferenciación y proliferación.
      • Desequilibrios entre escritores y borradores que alteran la programación genética y subyacen a los procesos patológicos. Caracterizar tales desequilibrios y las enzimas específicas involucradas puede proporcionar información sobre la patología de la enfermedad, desde cánceres hasta trastornos autoinmunes.
      • Nuevas dianas farmacológicas y estrategias terapéuticas. Una vez que se identifica un desequilibrio, se pueden desarrollar fármacos para impactar la actividad de estas enzimas y corregir el desequilibrio, ofreciendo nuevas estrategias terapéuticas contra enfermedades que hasta ahora han eludido los esfuerzos médicos. Por ejemplo, se están desarrollando muchos inhibidores de HDAC como fármacos novedosos contra cánceres y enfermedades inflamatorias como la artritis y la diabetes tipo I.

      Para los esfuerzos de desarrollo de fármacos, los compuestos pueden analizarse fácilmente por su impacto en la actividad de redacción y borrado.

      Caracterización de las vías de metilación de histonas

      En general, los ensayos de histona metiltransferasa (HMT) son difíciles de desarrollar y la mayoría tiene varios inconvenientes debido al diseño del ensayo. Los ensayos de HMT típicos utilizan 3 H-SAM como donante de metilo y miden la S-adenosilhomocisteína (SAH) como un subproducto general de la reacción de metilación. Sin embargo, esto requiere

      • Manipulación de material radiactivo
      • Alta sensibilidad para superar bajos kgato (rotación típicamente & lt 1 min-1) y KMETRO valores para el donante de metilo, SAM
      • Purificación previa de complejos de enzima / proteína para evaluar la actividad de HMT específicos

      Los ensayos de actividad de Abcam HMT superan estas dificultades, evaluando la actividad de HMT específicos con anticuerpos que detectan el producto metilado específico, proporcionando:

      • Fácil detección colorimétrica o fluorométrica, sin radiactividad
      • Compatibilidad con extractos nucleares o proteínas purificadas (el ensayo es específico para la modificación de interés)
      • Datos en 3 horas

      Para obtener más información sobre nuestros ensayos de metilación de histonas haga clic aquí.

      Caracterización de la actividad de la desmetilasa

      Los ensayos de actividad de histona desmetilasa típicamente miden la formación de formaldehído, un subproducto de la desmetilación. Por lo tanto, son susceptibles a la interferencia de detergentes, grupos tiol y una variedad de iones. De manera similar a los ensayos de metilación, estos ensayos no son específicos para ninguna desmetilasa y solo se pueden realizar con proteína purificada.

      Los ensayos de histona desmetilasa de Abcam evitan estos problemas midiendo directamente la formación del producto desmetilado, proporcionando:

      • Mayor sensibilidad (20 a 1000 veces) en comparación con los ensayos basados ​​en formaldehído
      • Datos más precisos sin interferencias de tioles, detergentes o iones
      • Compatibilidad con extractos nucleares o proteína purificada (debido a la especificidad del ensayo para la modificación de interés)
      • Mide la actividad desmetilasa de una amplia gama de especies, incluidas células / tejidos de mamíferos, plantas y bacterias.
      • Formato de microplaca rápido con lecturas colorimétricas o fluorométricas simples
      • Datos en 3 horas

      Para obtener más información sobre nuestros ensayos de histona desmetilasa haga clic aquí.

      Caracterización de las vías de acetilación de histonas

      Abcam ofrece kits para analizar la actividad HAT general y específica de H4. Estos ensayos miden la transferencia catalizada por HAT de grupos acetilo desde el donante de Acetil-CoA a los péptidos de histona, lo que genera el péptido acetilado y CoA-SH. El subproducto CoA-SH luego se mide mediante métodos colorimétricos o fluorométricos:

      • Ensayos colorimétricos: CoA-SH sirve como una coenzima esencial para producir NADH, que reacciona con el colorante de tetrazolio soluble para generar un producto que puede detectarse espectrofotométricamente. Este ensayo es ideal para estudios cinéticos, con detección continua.
      • Ensayos fluorométricos: CoA-SH reacciona con un revelador y una sonda para generar un producto que se detecta fluorométricamente.

      Caracterización de la actividad de la histona desacetilasa

      Las proteínas HDAC se dividen en cuatro grupos principales (clase I, clase IIA, clase IIB, clase III, clase IV) según la función y la similitud de la secuencia de ADN. Las clases I, IIA y IIB se consideran HDAC "clásicas" cuyas actividades son inhibidas por tricostatina A (TSA), mientras que la clase III es una familia de proteínas dependientes de NAD + (sirtuinas (SIRT)) no afectadas por TSA. La clase IV se considera una clase atípica por sí sola, basada únicamente en la similitud de la secuencia de ADN con las demás.

      Cada una de estas clases está asociada con diferentes programas celulares y puede ensayarse individualmente con varios ensayos fluorométricos. Por ejemplo, los SIRT se asocian típicamente con cánceres y enfermedades neurológicas. La detección de la actividad de SIRT o la identificación de fármacos que afecten a la actividad de SIRT pueden indicar nuevos diagnósticos o estrategias terapéuticas para estas enfermedades.

      Los ensayos fluorométricos utilizan un sustrato peptídico acetilado con un fluoróforo y un inhibidor en sus terminales amino y carboxilo. Una vez que el sustrato está desacetilado, puede ser escindido por una peptidasa, liberando el fluoróforo del extintor. El posterior aumento de la intensidad de fluorescencia del fluoróforo es directamente proporcional a la actividad desacetilasa.

      Inhibir escritores y borradores

      Puedo ser útil para inhibir estas enzimas modificadoras utilizando moléculas pequeñas y luego evaluar las consecuencias posteriores para sondear la participación y las funciones biológicas de las modificaciones de histonas. Por lo tanto, los inhibidores de escritores y borradores son herramientas vitales para comprender las funciones de las vías de modificación epigenética. También son esenciales para la validación de objetivos "farmacológicos" en el contexto de estudios preclínicos tanto en contextos académicos como industriales.

      Lectores / traductores de modificación de histonas

      Las modificaciones de histonas regulan las propiedades físicas de la cromatina y su estado transcripcional correspondiente, ya sea directamente (por ejemplo, grupos acetilo que repelen el ADN cargado negativamente para crear una conformación de cromatina abierta) o mediante adaptadores de proteínas denominados efectores. Las proteínas efectoras reconocen y se unen a marcas epigenéticas específicas y, posteriormente, reclutan maquinaria molecular para alterar la estructura de la cromatina. Estos lectores epigenéticos determinan el resultado funcional de las modificaciones de histonas traduciendo el código de histonas en acción.

      Los dominios efectores reconocen modificaciones específicas de histonas

      Las proteínas efectoras reconocen y se unen a las marcas de modificación de histonas a través de dominios efectores, conocidos como módulos (Tabla 2).

      Tabla 2. Reconocimiento de marcas de histonas por módulos o proteínas de unión a histonas.


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