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10.2A: Interfase - Biología


Las células deben crecer y duplicar sus estructuras internas durante la interfase antes de que puedan dividirse durante la mitosis.

Objetivos de aprendizaje

  • Describe los eventos que ocurren durante la interfase.

Puntos clave

  • Hay tres etapas de interfase: G1 (primer espacio), S (síntesis de nuevo ADN) y G2 (segundo espacio).
  • Las células pasan la mayor parte de su vida en interfase, específicamente en la fase S donde se debe copiar el material genético.
  • La célula crece y realiza funciones bioquímicas, como la síntesis de proteínas, en el G1 fase.
  • Durante la fase S, el ADN se duplica en dos cromátidas hermanas y los centrosomas, que dan lugar al huso mitótico, también se replican.
  • En el G2 fase, se repone la energía, se sintetizan nuevas proteínas, se desmantela el citoesqueleto y se produce un crecimiento adicional.

Términos clave

  • interfase: etapa del ciclo de vida de una célula en la que la célula crece y el ADN se replica
  • cromátida hermana: cualquiera de las dos hebras idénticas de un cromosoma (material de ADN) que se separan durante la mitosis
  • huso mitótico: el aparato que orquesta el movimiento de los cromosomas durante la mitosis

Interfase

Durante la interfase, la célula experimenta procesos de crecimiento normales mientras se prepara para la división celular. Para que una célula pase de la interfase a la fase mitótica, se deben cumplir muchas condiciones internas y externas. Las tres etapas de la interfase se denominan G1, S y G2 .

GRAMO1 Fase (primer espacio)

La primera etapa de la interfase se llama G1 fase (primer espacio) porque, desde un aspecto microscópico, se aprecian pocos cambios. Sin embargo, durante el G1 etapa, la célula es bastante activa a nivel bioquímico. La célula crece y acumula los componentes básicos del ADN cromosómico y las proteínas asociadas, así como reservas de energía suficientes para completar la tarea de replicar cada cromosoma en el núcleo.

Fase S (síntesis de ADN)

La fase de síntesis de la interfase es la más larga debido a la complejidad del material genético que se duplica. A lo largo de la interfase, el ADN nuclear permanece en una configuración de cromatina semi-condensada. En la fase S, la replicación del ADN da como resultado la formación de pares idénticos de moléculas de ADN, cromátidas hermanas, que están firmemente unidas a la región centromérica. El centrosoma se duplica durante la fase S. Los dos centrosomas darán lugar al huso mitótico, el aparato que orquesta el movimiento de los cromosomas durante la mitosis. En el centro de cada célula animal, los centrosomas de las células animales están asociados con un par de objetos parecidos a varillas, los centriolos, que forman ángulos rectos entre sí. Los centríolos ayudan a organizar la división celular. Los centríolos no están presentes en los centrosomas de otras especies eucariotas, como las plantas y la mayoría de los hongos.

GRAMO2 Fase (segundo espacio)

En el G2 fase, la célula repone sus reservas de energía y sintetiza las proteínas necesarias para la manipulación cromosómica. Algunos orgánulos celulares se duplican y el citoesqueleto se desmantela para proporcionar recursos para la fase mitótica. Puede haber crecimiento celular adicional durante G2. Los preparativos finales para la fase mitótica deben completarse antes de que la célula pueda entrar en la primera etapa de la mitosis.


La arquitectura de los cromosomas en interfase y el posicionamiento de los genes se ven alterados por cambios en la metilación del ADN y la acetilación de histonas.

Ana Paula Santos, Rita Abranches, Eva Stoger, Alison Beven, Wanda Viegas, Peter J. Shaw La arquitectura de los cromosomas en interfase y el posicionamiento de los genes se ven alterados por cambios en la metilación del ADN y la acetilación de histonas. J Cell Sci 1 de diciembre de 2002 115 (23): 4597–4605. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.00160

Los núcleos de trigo tienen una organización en interfase notablemente bien definida, y hemos utilizado esto para determinar la relación entre la organización de los cromosomas en interfase, el posicionamiento de transgenes específicos y los cambios inducidos en la metilación del ADN y la acetilación de histonas, utilizando hibridación in situ e imágenes confocales en 3D. Después de germinar semillas, ya sea en presencia de 5-azacitidina (5-AC), que conduce a la hipometilación del ADN, o tricostatina A (TSA), que da como resultado la hiperacetilación de histonas, la arquitectura de los brazos del cromosoma en interfase cambia significativamente a pesar de que el Rabl se mantiene la configuración. Esto sugiere que estos tratamientos remodelan segmentos cromosómicos específicos, pero que existe un fuerte vínculo entre los centrómeros y los telómeros con la envoltura nuclear. En líneas que llevan múltiples integraciones de transgenes en sitios ampliamente separados, mostramos que los múltiples transgenes, que generalmente se colocan en la interfase, se dispersan después del tratamiento con 5-AC o TSA y que hay un aumento en la actividad del transgén. Esto sugiere que la colocalización / dispersión de los transgenes puede ser una función de la organización cromosómica de interfase específica y que estas líneas que contienen múltiples copias de transgenes pueden estar todas parcialmente reprimidas transcripcionalmente.


La primera etapa de la interfase se llama GRAMO1 fase (primer espacio) porque, desde un aspecto microscópico, se aprecian pocos cambios. Sin embargo, durante el G1 etapa, la célula es bastante activa a nivel bioquímico. La célula está acumulando los componentes básicos del ADN cromosómico y las proteínas asociadas, así como acumulando suficientes reservas de energía para completar la tarea de replicar cada cromosoma en el núcleo.

A lo largo de la interfase, el ADN nuclear permanece en una configuración de cromatina semi-condensada. En el Fase S, La replicación del ADN puede proceder a través de los mecanismos que dan como resultado la formación de pares idénticos de moléculas de ADN (cromátidas hermanas) que están firmemente unidas a la región centromérica. El centrosoma se duplica durante la fase S. Los dos centrosomas darán lugar a la huso mitótico, el aparato que orquesta el movimiento de los cromosomas durante la mitosis. En el centro de cada célula animal, los centrosomas de las células animales están asociados con un par de objetos en forma de varilla, el centriolos, que forman ángulos rectos entre sí. Los centríolos ayudan a organizar la división celular. Los centríolos no están presentes en los centrosomas de otras especies eucariotas, como las plantas y la mayoría de los hongos.


Fase G0

La fase G0 puede ocurrir justo después de la mitosis y justo antes de la fase G1, o una célula en la fase G1 puede entrar en la fase G0. La entrada en G0 se conoce como salida del ciclo celular. Se dice que las células que maduran para convertirse en células altamente especializadas se diferencian. Las células salen del ciclo celular y entran en G0 para diferenciarse. Las células terminalmente diferenciadas son aquellas que nunca vuelven a entrar en el ciclo celular, lo que significa que permanecen en G0 y nunca se dividen. Sin embargo, algunas celdas pueden activarse para que salgan de G0 y vuelvan a ingresar a G1, lo que les permite dividirse nuevamente.


10.2A: Interfase - Biología

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En las células eucariotas, la mayor parte del ciclo celular es la interfase, que se divide en tres etapas, G1, S y G2. En g1, la primera fase de brecha, una célula hija recién generada crece de tamaño y se prepara para la duplicación del ADN en la siguiente fase.

Ahora, en S, la fase de síntesis, las células duplican su ADN nuclear, que permanece empaquetado como cromatina. Las células también duplican los centrosomas, la estructura organizadora de microtúbulos que forma el aparato del huso mitótico. Finalmente, en G2En la segunda fase de brecha, las células continúan creciendo, multiplicando orgánulos y proteínas que se requieren para la mitosis y reponen sus reservas de energía. La célula ahora está lista para entrar en la primera etapa de la mitosis.

10.5: Interfase

El ciclo celular ocurre durante aproximadamente 24 horas (en una célula humana típica) y en dos etapas distintas: interfase, que incluye tres fases del ciclo celular (G1, S y G2) y mitosis (M). Durante la interfase, que ocupa aproximadamente el 95 por ciento de la duración del ciclo celular eucariota, las células crecen y replican su ADN en preparación para la mitosis.

Fases de la interfase

Después de cada período de mitosis y citocinesis, las células eucariotas entran en la interfase, durante la cual crecen y replican su ADN en preparación para la siguiente división mitótica.

Durante el G1 (intervalo 1), las células crecen continuamente y se preparan para la replicación del ADN. Durante esta fase, las células son metabólicamente activas y copian orgánulos y moléculas bioquímicas esenciales, como las proteínas.

En la siguiente fase S (síntesis) de la interfase, las células duplican su ADN nuclear, que permanece empaquetado en cromatina semi-condensada. Durante la fase S, las células también duplican el centrosoma, una estructura organizadora de microtúbulos que forma el aparato del huso mitótico. El huso mitótico separa los cromosomas durante la mitosis.

En el G2 (intervalo 2), que sigue a la síntesis de ADN, las células continúan creciendo y sintetizando proteínas y orgánulos para prepararse para la mitosis.

En las células humanas, el G1 La fase dura aproximadamente 11 horas, la fase S dura aproximadamente 8 horas y la fase G2 La fase dura unas 4 horas. Durante G1, las células son diploides (2n, un par de cada cromosoma). Después de la replicación en la fase S, las células aumentan su contenido de ADN a 4n. Las células permanecen 4n hasta la citocinesis, momento en el que su contenido de ADN se reduce a 2n.

Schafer, K. A. & ldquoThe Cell Cycle: A Review. & Rdquo Patología veterinaria 35, no. 6 (1 de noviembre de 1998): 461 & ndash78. [Fuente]


¿Cuáles se replican durante la interfase? cromátidas hermanas cromosomas centrómeros núcleos

El ciclo celular se divide en 2 fases, es decir, la fase de interfase y la fase de mitosis. La fase de mitosis tiene 4 etapas, a saber, la etapa G1, S, G2 y G0. En la etapa de síntesis, la célula replica sus cromosomas para producir 2 cromátidas hermanas idénticas.

La etapa de interfase del ciclo celular comienza con la etapa G1. A veces, puede existir una etapa G0 dependiendo de la celda. Solo las células que no se diferencian entran en esta etapa y permanecen hasta que mueren. Las únicas células que entran en esta etapa son las neuronas y las células cardíacas (células que forman el tejido cardíaco). En la etapa G1 de la interfase, la célula acumula proteínas y energía necesarias para el ciclo celular. El ADN celular también se verifica para detectar errores y, si se encuentran, el ciclo termina. Luego, la célula entra en la fase S o de síntesis donde se produce la síntesis de ADN y proteínas. Los cromosomas se duplican para formar 2 cromátidas hermanas idénticas que se dividirán una vez que la célula forme una célula hija idéntica. También se prepara para la siguiente etapa. G2 es la siguiente etapa y la célula nuevamente busca errores y mutaciones en el ADN y luego duplica sus orgánulos e inclusiones celulares en preparación para la mitosis. Ahí es donde termina la etapa de Interfase. La siguiente etapa es la mitosis y se divide en la etapa de división del núcleo (cariocinesis) y la etapa de división del citoplasma (citocinesis). La mitosis tiene 5 etapas, es decir, profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. La citocinesis se superpone con la telofase y en algunas células no ocurre y si no ocurre, entonces la célula que se forma será multinucleada. Al final, la celda se pellizcará en el centro y las 2 células hijas idénticas comenzarán a funcionar como entidades separadas.

Obtenga más información sobre la interfase:

Obtenga más información sobre el ciclo celular:

La respuesta correcta es Cromosomas.

Después de la replicación del ADN durante la interfase del ciclo celular, los cromosomas se componen de dos cromátidas idénticas unidas al centrómero. Cada cromatida está formada por una molécula de ADN (el nucleofilamento) asociada con proteínas, las histonas, alrededor de las cuales se enrolla para formar nucleosomas. En los extremos de cada cromátida hay telómeros, que consisten en secuencias de ADN repetitivas que brindan protección a las terminaciones cromosómicas. Los telómeros y el centrómero no codifican información genética, es ADN no codificante.


Complejos de poros nucleares y transporte nucleocitoplasmático: métodos

Kazuhiro Maeshima,. Naoko Imamoto, en Métodos en biología celular, 2014

Montaje de NPC en interfase

Durante la interfase, el número de NPC en la superficie nuclear se duplica en preparación para la reentrada en la siguiente mitosis (Imamoto & amp Funakoshi, 2012 Maul et al., 1972 Fig. 11.1 A). Este proceso, que implica el montaje de NPC en un NE intacto (también denominado de novo Asamblea NPC), también ocurre en algunas células de vertebrados que no se dividen, como en la ovogénesis, y es el modo único de ensamblaje de poros en organismos con mitosis cerrada, como levaduras de gemación y fisión (revisado en Doucet & amp Hetzer, 2010). Sin embargo, como su estudio requirió el desarrollo de ensayos específicos, hasta ahora se sabe menos sobre el mecanismo de formación de NPC en interfase que sobre los procesos posmitóticos.

Figura 11.1. Métodos de fusión celular y fotoblanqueo para la visualización del ensamblaje de NPC en interfase

(A) El número de complejos de poros nucleares (NPC) casi se duplica durante la interfase en células en división. (B) Representación esquemática del método de fusión celular. Las células HeLa que expresan Venus-Nup se utilizan como células donantes y las células HeLa que expresan CFP-H2B se utilizan como células aceptoras (arriba). Las células donantes y aceptoras sincronizadas con G1 se tratan con polietilenglicol (PEG) para producir heterocariones (centro). De dieciséis a dieciocho horas después, deberían aparecer nuevos NPC marcados con Venus-Nup en el núcleo aceptor (abajo a la derecha), que tiene la señal más brillante de CFP-H2B. (C) El método de fotoblanqueo. Las regiones de la superficie nuclear en las células de la fase G1 que expresan Venus-Nup (arriba) son fotoblanqueadas por un láser de 488 nm (centro). A las 16 h después del blanqueamiento, aparecen nuevos NPC marcados con Venus-Nup en las áreas blanqueadas, que representan NPC recién sintetizados (abajo).

Para estudiar la formación de NPC en interfase, se deben cuantificar los NPC recién ensamblados (nacientes) en la superficie nuclear. Si bien se han desarrollado enfoques para examinar el ensamblaje de NPC en interfase utilizando in vitro ensayos de reconstitución nuclear basados ​​en extractos de huevo de Xenopus (revisados ​​en Doucet & amp Hetzer, 2010), los estudios de este proceso en células de mamíferos son aún limitados: los enfoques actuales involucran notablemente (i) comparaciones de niveles de NPC, basadas en la intensidad de fluorescencia total en el NE en G1 versus G2 en células sincronizadas (Doucet, Talamas, & amp Hetzer, 2010), (ii) imágenes de células vivas de alta resolución en líneas celulares que expresan de manera estable GFP-Nups que permitieron la observación de nuevos eventos de ensamblaje de NPC en lugares previamente libres de poros (Dultz & amp Ellenberg, 2010), o (iii) la localización simultánea de dos Nups distintos en la superficie NE en células fijas o vivas que revelaron notablemente el reclutamiento más temprano de Pom121 en comparación con Nup107 en el ensamblaje de NPC en interfase (Doucet et al., 2010 Dultz & amp Ellenberg, 2010).

Sin embargo, el recuento de NPC, incluso cuando semiautomatizados (Dultz & amp Ellenberg, 2010), resultó laborioso y la resolución de microscopía óptica es insuficiente para distinguir entre NPC adyacentes. Además, el aumento de la superficie nuclear a medida que avanza el ciclo celular también afecta a la densidad de NPC, lo que complica el análisis (Dultz & amp Ellenberg, 2010). La presencia de islas sin poros dentro del NE en las células G1 tempranas de células humanas en división también puede introducir sesgos en estos análisis (Maeshima et al., 2006).

Como un enfoque alternativo para visualizar directamente NPC nacientes en las superficies nucleares durante la interfase, hemos utilizado un enfoque de fotoblanqueo (FRAP, Figs. 11.1 C y 11.4) (Iino et al., 2010 Maeshima et al., 2010) y también desarrollamos un nuevo método basado en la técnica de fusión celular (Figs. 11.1 B, 11.2 y 11.3 Maeshima et al., 2010, 2011 Funakoshi et al., 2011).

Figura 11.2. Visualización de la formación de nuevos NPC mediante el método de fusión celular

(A) Un esquema simplificado de métodos de fusión celular. (B) Inmediatamente después de la fusión (0 h), los núcleos donantes de las células que expresan Nup133-Venus muestran muchos puntos fluorescentes brillantes que representan NPC, mientras que no se observan puntos detectables en los núcleos aceptores de las células que expresan CFP-H2B. (C) Las señales fluorescentes de Venus en los núcleos aceptores aumentan de manera dependiente del tiempo (4, 8, 12 y 18 h). En la vista central (segunda fila), la intensidad media relativa (borde aceptor / borde donante) se muestra entre paréntesis en la imagen. En la vista de superficie (tercera fila), el número entre paréntesis es la densidad de puntos en la superficie nuclear. Barra de escala, 10 μm.

Las imágenes fueron reproducidas de Maeshima et al. (2010), con autorización.

Figura 11.3. La combinación del tratamiento de ARNip y el método de fusión celular revela la implicación de Pom121 en el ensamblaje de NPC en interfase

(A) Representación esquemática del método de ensamblaje de NPC en interfase combinado con tratamiento de ARNip. (B) Efecto del agotamiento de Pom121 (Pom121KD) en el ensamblaje de NPC en interfase. Las puntas de flecha indican núcleos aceptores en heterocariones. A las 16 h posteriores a la fusión (16 h, paneles 7-12), se observa una clara señal de borde nuclear con Venus-Nup107 en los núcleos aceptores de los heterocariones de control (panel 7) que también están fuertemente marcados con el anticuerpo anti-Pom121 (panel 9). Por el contrario, se observa una señal Venus-Nup107 muy baja en los núcleos del aceptor Pom121 KD (paneles 10-12). Barra de escala, 10 μm. (C) Resultados de cuantificación de las intensidades de fluorescencia de Pom121 y Venus-Nup107 en el borde nuclear de núcleos en heterocariones. Intensidades fluorescentes de Venus-Nup107 (gráficos b, d) o Pom121 detectadas por tinción de inmunofluorescencia (a, c) en el borde de núcleos derivados de núcleos aceptores (a, b) y núcleos donantes (c, d) en células con o sin Pom121 KD. Se trazaron los valores medios y las desviaciones estándar se muestran como porcentajes relativos al nivel de Pom121 KD (-) en el tiempo = 0 (marcado con asteriscos en los gráficos). Pom121 KD (-): norte = 4 (0 h), norte = 22 (16 h). Pom121 KD (+): norte = 9 (0 h), norte = 32 (16 h).

El esquema y las imágenes fueron reproducidos de Funakoshi, Clever, Watanabe e Imamoto (2011), con permiso.


Información de soporte

Imágenes Raw S1. Archivos de imagen originales (sin ajustar y sin recortar) para todas las inmunotransferencias y geles representados en cada panel de figuras.

Datos S1. Hoja de cálculo de Excel que contiene, en hojas separadas, los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras.

S1 Fig. Caracterización del daño telomérico inducido por FokI-TRF1 después de la deleción de ATRX.

(A) Perfiles FACS de ATRX F / F MEF tratados con BrdU 4 días después de Cre para monitorear el índice de fase S. (B) Cuantificación de focos de PML por célula en ATRX F / F MEF, como se ensayó en la Fig. 1E. Barras: medias y SD de las celdas & gt400. (C) Co-localizaciones en ATRX F / F MEF detectadas por IF-FISH para PML (IF, verde) y telómeros (FISH, rojo), e IF para PML (verde) y centrómeros (anticuerpo anti-centrómero, ACA, rojo). El ADN se tiñó con DAPI. (D) Cuantificación de la fracción de telómeros que co-localiza con ACA, como se ensayó en (C). Cada punto de datos representa la fracción de telómeros que se co-localizan con ACA en una celda. Barras: medias y SD de celdas & gt300. (E-F) Cuantificación del porcentaje de células con co-localizaciones de PML-ACA (E) o PML-TelC (F) ≥10, como se ensayó en (C). Barras: medias y DE de 3 experimentos de células & gt100 cada uno. (GRAMO) La cuantificación del cromosoma termina con intercambios recíprocos o de un solo telómero en ATRX F / F MEF detectados por CO-FISH, de la Fig. 1G. Las comparaciones por pares en el panel G se derivaron de un t prueba. Todos los demás pag-Los valores se derivaron de un ANOVA de una vía con corrección de Tukey. Símbolos como en la Fig. 1. Los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras se pueden encontrar en S1 Data. ATRX, alfa talasemia / síndrome de retraso mental remodelador de cromatina ligado al cromosoma X ATRX F / F, embrión femenino con dos alelos ATRX floxados BrdU, bromodesoxiuridina Cre, recombinasa que actúa en sitios Lox FACS, clasificación de células activadas por fluorescencia FISH, hibridación in situ por fluorescencia FokI- TRF1, dominio de nucleasa FokI y proteína de fusión de factor de unión de repetición telomérica 1 IF, inmunofluorescencia MEF, fibroblasto embrionario de ratón PML, leucemia promielocítica SD, desviación estándar TelC, sonda de telómero rica en C [CCCTAA]3

S2 Fig. Shelterin y SA1 permanecen asociados con el ADN telomérico a pesar de la pérdida de cohesión.

(A) FISH de las sondas del brazo (rojo) y subtelomérico (verde) para los cromosomas 10 y 8 de ratón en las extensiones de metafase de los MEF de KO condicionales ATRX. (B) FISH de las sondas del brazo (rojo) y subtelomérico (verde) en el cromosoma 8 en las células en interfase de los MEF descritos en la figura 2A. (C) Cuantificación de las señales FISH del cromosoma 8 observadas como dobletes. Barras: medias y desviaciones estándar de 3 experimentos. (D) ChIP telomérico en ATRX F / F MEF que expresan Flag-HA2-TPP1 (anti-Flag) y Myc-POT1 (anti-Myc). PI, suero preinmune. (MI) Inmunotransferencias para ATRX y TPP1 (HA) 4 días después de Hit & ampRun Cre o aproximadamente 40 PD después de pWZL-Cre. La γtubulina sirve como control de carga. (F) Cuantificación de las señales de ChIP teloméricas de 2-3 experimentos independientes, como se analiza en (D). Barras: medias y SEM. Se restó el fondo (PI) y las señales de ChIP se normalizaron a la entrada. (GRAMO) FISH de las sondas del brazo (rojo) y subtelomérico (verde) en el cromosoma 4 humano en una metafase propagada a partir de células HeLa 1.3. (H) Inmunoblot para ATRX y SA1 después de la depleción de shRNA en HeLa 1.3. La γtubulina sirve como control de carga. (I) FISH de las sondas del brazo (rojo) y subtelomérico (verde) en el cromosoma 4 en las células en interfase descritas en (H). (J) Cuantificación de las señales FISH del cromosoma 4 observadas como dobletes. Barras: medias y SEM de 2 shRNA independientes para ATRX y SA1. Las comparaciones por pares en el panel (C) se derivaron de un t prueba. Todos los demás pag los valores se derivaron de un ANOVA de una vía con corrección de Tukey. Símbolos como en la Fig. 1. Los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras se pueden encontrar en S1 Data. ATRX, alfa talasemia / síndrome de retraso mental Remodelador de cromatina ligado al cromosoma X ATRX F / F, embrión femenino con dos alelos ATRX floxados ChIP, inmunoprecipitación de cromatina Cre, recombinasa que actúa en sitios Lox FISH, hibridación in situ con fluorescencia Flag-HA2-TPP1, subunidad del complejo de refugio de ACD marcado con epítopo y factor de reclutamiento de telomerasa KO, MEF knockout, fibroblasto embrionario de ratón Myc-POT1, protección de telómeros 1 PD marcada con epítopo, PI de duplicación de la población, pWZL sérico preinmune, vector retroviral SA1, estroma antígeno 1 SD, desviación estándar SEM, error estándar del ARNhc medio, ARN en horquilla corta.

S3 Fig. Represión de los sellos ALT en U2OS por la reintroducción de ATRX de larga duración.

(A) Mancha de puntos representativa que detecta círculos en C con un 32 P- [CCCTAA] etiquetado en el extremo4 sonda y cuantificación de la abundancia del círculo C en las células descritas en la Fig. 2I. Los valores se presentan en relación con U2OS (establecido en 100). Barras: medias y desviaciones estándar de 3 experimentos. Todos pag los valores se derivaron de un ANOVA de una vía con corrección de Tukey. Símbolos como en la Fig 1. (B) La tinción de CO-FISH en metafase se extiende desde las líneas celulares indicadas, como en la Fig. 1I. Los extremos de los cromosomas que muestran intercambios de telómeros se indican con una x, los ECTS se marcan con una flecha y las asociaciones hermanas se indican con un asterisco. (C) Cuantificación de los intercambios de telómeros detectados por CO-FISH. Cada punto de datos representa el porcentaje de extremos cromosómicos con intercambios de telómeros en una extensión de metafase. Barras: medias y SD. (D) Tinción FISH de líneas celulares descritas en la Fig. 2I con sondas dirigidas al brazo (rojo) y las regiones subteloméricas (verde) del Cromosoma 4. Los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras se pueden encontrar en S1 Data. ALT, alargamiento alternativo de los telómeros ATRX, alfa talasemia / síndrome de retraso mental C-circle remodelador de cromatina ligado al cromosoma X, extracromosómico, ADN telomérico circular con una hebra rica en C intacta CO-FISH, orientación cromosómica, hibridación in situ fluorescente ECTS, señal telomérica extracromosómica FISH, hibridación in situ de fluorescencia SD, desviación estándar U2OS, línea celular de osteosarcoma humano.

S4 Fig. Generación de SA1 KO MEF.

(A) Esquema del locus SA1 de ratón, que identifica características relevantes para la edición de genes mediada por CRISPR / Cas9. (B) Secuencias de ADN de los alelos SA1 editados en clones KO derivados de CRISPR / Cas9 obtenidos por clonación TOPO (Thermo Fisher Scientific) de productos de PCR utilizando los cebadores que se muestran en (A). Se especifican las ediciones asociadas con cada alelo. El texto en negrita indica la secuencia del exón 10 y el texto normal identifica la secuencia del intrón. (CD) Cuantificación de asociaciones de telómeros hermanos (C) y no alélicos (D) en células de control y SA1 KO (no Cre) detectadas por CO-FISH (como en la Fig. 3). Los puntos de datos representan el porcentaje de extremos cromosómicos del brazo largo que muestran asociaciones hermanas y el porcentaje de todas las cromátidas asociadas con telómeros no alélicos en una extensión en metafase. Barras: medias y DE de 19 a 20 metafases de 2 experimentos. Todos pag-Los valores se derivaron de un ANOVA de una vía con corrección de Tukey. Símbolos como en la Fig. 1. Los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras se pueden encontrar en S1 Data. Cas9, proteína asociada a CRISPR 9 CO-FISH, hibridación in situ de fluorescencia con orientación cromosómica Cre, recombinasa que actúa en sitios Lox CRISPR, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas KO, MEF knockout, ns de fibroblastos embrionarios de ratón, PCR no significativa, reacción en cadena de la polimerasa SA1, antígeno estromal 1 SD, desviación estándar.

S5 Fig. Caracterización de fenotipos similares a ALT en SA1 KO MEF.

(C.A) Cuantificación del número de TIF por célula (A), co-localizaciones de telómero-PML (APB) por célula (B) o focos de PML por célula (C) en MEF que expresan FokI WT -TRF1, como se analiza en la figura 4. Barras : medias y DE de las células & gt300. Todos pag-Los valores se derivaron de un ANOVA de una vía con corrección de Tukey. Símbolos como en la Fig. 1. Los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras se pueden encontrar en S1 Data. ALT, alargamiento alternativo de los telómeros APB, cuerpo de LMP asociado a ALT FokI WT -TRF1, dominio de nucleasa FokI de tipo salvaje y proteína de fusión del factor de unión de repetición telomérica 1 KO, ns knockout, MEF no significativo, LMP de fibroblasto embrionario de ratón, leucemia promielocítica SA1, antígeno estromal SD, desviación estándar TIF, focos inducidos por disfunción de los telómeros.

S6 Fig. Generación y caracterización de DAXX KO MEFs.

(A) Esquema del locus DAXX de ratón, que identifica características relevantes para la edición de genes mediada por CRISPR / Cas9. (B) Secuencias de ADN de los alelos DAXX editados en 2 clones ATRX F / y KO derivados de CRISPR / Cas9 obtenidos mediante clonación TOPO (Thermo Fisher Scientific) de productos de PCR utilizando los cebadores que se muestran en (A). Se especifican las deleciones asociadas con cada alelo. (C-E) Cuantificación del número de TIF por célula (C), co-localizaciones de telómero-PML (APB) por célula (D) o focos de PML por célula (E) en células que expresan FokI WT -TRF1, como se analiza en la Fig. 5. Barras: medias y DE de aproximadamente 300 celdas para DAXX KO MEF y aproximadamente 200 celdas para MEF de control. (F) Cuantificación del número de focos de PML por célula en el control y una población de células dirigida a DAXX que expresan FokI-ER T2 -TRF1, después de la deleción de ATRX mediada por Cre o depleción de ARNhc de SA1 / SA2 (como se ensayó en la Fig. 6D). Barras: medias y desviaciones estándar de las células & gt330. Las comparaciones por pares en los paneles C, D y E se derivaron de un t prueba. Todos los demás pag-Los valores se derivaron de un ANOVA de una vía con corrección de Tukey. Símbolos como en la Fig. 1. Los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras se pueden encontrar en S1 Data. APB, cuerpo de LMP asociado a ALT ATRX, alfa talasemia / síndrome de retraso mental remodelador de cromatina ligado al cromosoma X ATRX F / y, embrión masculino con un solo alelo Cas9 floxado, proteína 9 Cre asociada a CRISPR, recombinasa que actúa en sitios Lox CRISPR, agrupados regularmente interespaciados repeticiones palindrómicas cortas DAXX, proteína asociada al dominio de muerte FokI-ER T2 -TRF1, proteína de fusión FokI-TRF1 inducible por tamoxifeno FokI WT -TRF1, dominio de nucleasa FokI de tipo salvaje y proteína de fusión del factor de unión de repetición telomérica 1 KO, MEF knockout, ratón fibroblastos embrionarios ns, PCR no significativa, reacción en cadena de la polimerasa PML, leucemia promielocítica SA1, antígeno estromal 1 SA2, antígeno estromal 2 SD, shRNA de desviación estándar, RNA de horquilla corta TIF, focos inducidos por disfunción de los telómeros.

S7 Fig. La deleción de DAXX no induce defectos de cohesión de los telómeros.

(A) FISH de las sondas del brazo (rojo) y subtelomérico (verde) en el cromosoma 10 en las células en interfase de los MEF de DAXX KO descritos en la Fig.5 y S6 Fig. (B) Cuantificación de las señales FISH del cromosoma 10 observadas como dobletes. Barras: medias y desviaciones estándar de 3 experimentos. (C) Inmunotransferencias que muestran la fosforilación de MCM2 S108 en células deficientes en TPP1, representativas de la señalización del daño del ADN y la deleción eficaz de TPP1. También se muestran la deleción mediada por Cre de ATRX y el direccionamiento CRISPR / Cas9 de SA1 y DAXX. La γtubulina sirve como control de carga. (D) Imágenes representativas de asociaciones de telómeros hermanos y no alélicos detectadas por tinción con CO-FISH (como en la figura 1G) en extensiones de metafase. Las asociaciones de telómeros están marcadas con asteriscos (*, asociación hermana **, asociación no alélica). (E-F) Cuantificación de asociaciones de telómeros hermanos (E) y no alélicos (F) detectadas por CO-FISH como en (D). Los puntos de datos representan el porcentaje de extremos cromosómicos del brazo largo que muestran asociaciones hermanas y el porcentaje de todas las cromátidas asociadas con telómeros no alélicos en una extensión en metafase. Barras: medias y desviaciones estándar de 3 experimentos. Las comparaciones por pares en el panel B se derivaron de un análisis de dos colas, no emparejado t prueba. Todos los demás pag-Los valores se derivaron de un ANOVA de una vía con corrección de Tukey. Símbolos como en la Fig. 1. Los datos numéricos subyacentes y el análisis estadístico para cada panel de figuras se pueden encontrar en S1 Data. ATRX, alfa talasemia / síndrome de retraso mental remodelador de cromatina ligado al cromosoma X Cas9, proteína asociada a CRISPR 9 CO-FISH, hibridación de fluorescencia in situ de orientación cromosómica Cre, recombinasa que actúa en sitios Lox CRISPR, agrupadas repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas DAXX, asociadas al dominio de muerte proteína FISH, hibridación in situ fluorescente KO, knockout MCM2, componente de complejo de mantenimiento de minicromosomas 2 MEF, fibroblasto embrionario de ratón ns, SA1 no significativo, antígeno estromal 1 SD, desviación estándar TPP1, subunidad del complejo de refugio ACD y factor de reclutamiento de telomerasa.


INTRODUCCIÓN

La envoltura nuclear (NE) es una proteína dinámica y un compartimento de membrana que puede perder y recuperar la compartimentación durante la interfase. La ruptura de la membrana nuclear en interfase generalmente ocurre cuando el estrés mecánico hace que la cromatina o el nucleoplasma se hernia a través de espacios en la lámina nuclear, la red de filamentos intermedios que proporciona soporte mecánico a la membrana. La tensión en la membrana sin soporte conduce a la rotura de la membrana (Houthaeve et al., 2018). Se ha observado la rotura de la membrana nuclear en una amplia gama de sistemas, incluidas las células que expresan mutaciones de laminopatía en cultivo e in vivo (De Vos et al., 2011 Earle et al., 2019), células cancerosas (Vargas et al., 2012 Yang et al., 2017), células sometidas a estrés mecánico en cultivo e in vivo (Tamiello et al., 2013 Maciejowski et al., 2015 Denais et al., 2016 Hatch y Hetzer, 2016 Raab et al., 2016 Stephens et al., 2017 Xia et al., 2018), y durante los primeros Caenorhabditis elegans desarrollo (Penfield et al., 2018), y las roturas se reparan de forma rutinaria y, en general, no son letales. Sin embargo, estudios recientes sugieren que la pérdida de compartimentación nuclear puede alterar la transcripción (De Vos et al., 2011) y provocan una mala localización de los orgánulos grandes (De Vos et al., 2011 Vargas et al., 2012) y daño al ADN (Maciejowski et al., 2015 Denais et al., 2016 Raab et al., 2016 Irianto et al., 2017 Takaki et al., 2017 Pfeifer et al., 2018 Stephens et al., 2019). Based on these data, nuclear membrane rupture is emerging as a major mechanism of genome instability and cell death in lamin-associated diseases and cancer (Isermann and Lammerding, 2017 Houthaeve et al., 2018).

Efficient repair of the nuclear membrane is likely critical for cell viability after rupture and many proteins active in postmitotic NE assembly localize to nucleus rupture sites (reviewed in LaJoie and Ullman, 2017). One such protein is BAF (barrier-to-autointegration factor), which accumulates at nucleus rupture sites (Denais et al., 2016 Raab et al., 2016 Penfield et al., 2018 Halfmann et al., 2019) and on mitotic chromatin, where it cross-links chromatin into a single mass (Samwer et al., 2017) and recruits LEM-domain (Lap2, emerin, Man1) NE transmembrane proteins (NETs) and lamin A (Jamin and Wiebe, 2015). A recent paper suggested BAF is also essential for interphase nuclear membrane repair via recruitment of membrane-bound proteins to rupture sites (Halfmann et al., 2019). However, it remains unknown how broad the requirement for BAF is and whether it is similarly required to repair ruptures that occur in cells where nuclear lamina organization is perturbed, as in the presence of laminopathy and cancer mutations (De Vos et al., 2011 Yang et al., 2017 Earle et al., 2019 Zhang et al., 2019).

To address these questions, we turned to a nuclear membrane rupture system based on depletion of LMNB1 in U2OS cells. S phase arrest causes individual nuclei to undergo multiple spontaneous ruptures of variable extent and our previous work suggested this cell line recapitulates all the major features of nucleus rupture and repair, including the kinetics of membrane rupture and repair (Vargas et al., 2012 Hatch and Hetzer, 2016). Our current data demonstrate that although BAF is a sensitive, reliable, and long-lasting marker of membrane rupture sites, it is not required for membrane repair. Instead, we observe a substantial lengthening of rupture duration after BAF depletion, with longer ruptures being more likely to be affected. Additional experiments with a LEM-domain binding mutant of BAF and depletion of the BAF-interacting proteins emerin, Lem-domain-containing protein 2 (LEMD2), and lamin A/C indicate BAF functions by recruiting LEM-domain proteins, which is likely especially critical to repair large nuclear membrane gaps.


Discusión

We demonstrated that most PCNSL (21/24, 88%) express FOXP1 protein in the tumor cell nuclei. Additional qPCR analysis of 19 PCNSL revealed that in PCNSL, the normal-size isoform 1 of FOXP1 was downregulated, whereas the N-terminally truncated isoforms 3 and 9 were upregulated, as compared with normal tonsillar centroblasts and to the GCB-DLBCL cell line Karpas-422. This FOXP1 signature has been considered to be specific for ABC-DLBCL ( 7). To circumvent the limitations of the small size of the stereotactic PCNSL biopsies (which precluded Western blot analysis), qPCR and Western blot studies were performed in 2 DLBCL cell lines that demonstrated a correlation between mRNA and protein levels.

We observed the expression of FOXP1 in cortical neurons in the normal adult human brain. This finding is consistent with recent reports of widespread FOXP1 mRNA and protein expression in the gray matter of the developing and adult mouse brain that have suggested a role for FOXP1 in brain development ( 14, 15). In addition, a few activated microglial cells, scattered meningeal lymphocytes, and arachnoidal cells were immunoreactive for FOXP1. Overall, however, FOXP1 immunoreactivity was remarkably weaker in the normal brain than that of the tumor cells of PCNSL. Therefore, and because the samples used for qPCR always contained at least 80% tumor cells, it is highly unlikely that the strong mRNA signal detected in PCNSL samples was caused by resident brain cells.

Forkhead box P1 has been described as an independent prognostic marker in systemic DLBCL of the non-GCB type, in which elevated FOXP1 mRNA levels, together with upregulation of IRF4 and BCL2 without a t(1418) translocation, were associated with an exceptionally poor clinical outcome ( 6). One may speculate that FOXP1 in PCNSL may contribute to their adverse prognosis, together with the universally strong upregulation of IRF4 and BCL2 mRNA and a prominent expression of the IRF4 and BCL2 protein ( 16) in the absence of a t(1418) translocation ( 17). In this regard, therefore, PCNSL are similar to extracerebral DLBCLs.

A study of an avian model of nephroblastoma detected foxp1 as a frequent target (i.e. in 5% of tumor clones) for retroviral integration. In all cases, the retrovirus targeted the second coding exon and presumably generated an N-terminal deletion but did not affect mRNA levels ( 18). It was concluded that truncated FOXP1 variants can interfere with normal gene function in a dominant-negative way. These observations imply that N-terminally truncated FOXP1 protein can act as an oncoprotein. A recent study analyzing pathway activation patterns identified 4 novel biologically homogeneous subgroups among DLBCL independent of the ABC/GCB classification. Compared with the other subgroups, pathway activation pattern 2 displayed significantly higher FOXP1 expression and was associated with a significantly worse prognosis ( 19). Whether PCNSL comprise subgroups on the basis of pathway activation patterns still remains to be elucidated.

Interestingly, preferential expression of truncated FOXP1 isoforms was described as a possible FOXP1-mediated oncogenic mechanism in systemic DLBCL cells ( 7). How the preferential expression of shorter FOXP1 isoforms is regulated is unclear. In systemic DLBCL, FOXP1 was recurrently affected by translocations and gains at 3p13 ( 20), yet, to date, this has not been addressed specifically in PCNSL. Forkhead box P1 dysregulation may, however, also occur in the absence of these aberrations ( 21).

In conclusion, tumor cells of most PCNSL express FOXP1 mRNA and protein. Furthermore, the preferential overexpression of truncated FOXP1 isoforms may contribute to poor prognosis in patients with PCNSL.